抑郁模型大鼠脑脊液miR-16与中缝核miR-16、5-羟色胺转运体表达的关联性研究

张冬阳　罗伏钢　王晟东　刘文娟　胡霖霖　李梅　张永华　李静　章隆　宋明芬

[摘要] 目的 研究抑郁模型大鼠脑脊液miR-16是否能反映中缝核miR-16水平的变化，并与中缝核5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）的表达相关。方法 将20只SD大鼠随机分为抑郁模型组和对照组，每组各10只。抑郁模型组大鼠接受21 d不可预知温和应激的刺激，对照组大鼠正常饲养。收集大鼠脑脊液测定miR-16，分离中缝核测定miR-16和SERT蛋白。比较模型组与对照组脑脊液miR-16、中缝核miR-16、SERT表达差异并分析三者的关联性。 结果 模型组大鼠脑脊液miR-16水平（0.19±0.10）和中缝核miR-16水平（0.65±0.22）均低于相应的对照组（0.35±0.12、0.84±0.18）（P<0.01），中缝核SERT水平（0.99±0.29）高于对照组（0.59±0.18）（P=0.002）。脑脊液miR-16与中缝核miR-16呈显著正相关关系（r=0.95，P=0.000），而且脑脊液miR-16与中缝核miR-16一样，与中缝核SERT呈显著负相关（r=-0.91，P=0.000）。 结论 抑郁模型大鼠脑脊液miR-16水平能反映中缝核miR-16水平，并与中缝核SERT表达相关，可能可作为抑郁症的生物标记物。

[关键词] 抑郁模型;miR-16;5-羟色胺转运体;脑脊液;中缝核

[中图分类号] R74          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2018）34-0029-05

抑郁症已成为仅次于心血管疾病的全球第二大死因和疾病负担[1]。然而，其发病机制尚不清楚。目前的研究表明，microRNAs（miRNAs）可能参与抑郁症的发生、发展[2，3]。miRNAs是体内非编码的小分子RNA，它们可与其靶基因mRNA的3′非翻译区结合，引起mRNA降解或者翻译抑制[4，5]。miRNAs属于表观遗传学的范畴，在生物发育和疾病发生发展中起重要作用[6-8]。miR-16被认为是参与抑郁症的重要miRNAs之一，其靶基因是5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）基因，SERT是调节脑组织内5-HT神经递质功能的重要生物分子[9]。研究表明，抑郁模型动物的脑脊液miR-16水平存在异常[10，11]，但是尚不清楚脑脊液miR-16如何参与抑郁症的发生与发展。本次实验探讨脑脊液miR-16与中缝核miR-16及其靶基因SERT的关联性，为阐明抑郁症的发病机制以及寻找抑郁症生物标志物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）级Sprague Dawley（SD）成年雌性大鼠20只[购买自浙江省医学科学院，动物合格证号：SCXK（浙）2014-0001]，按随机数字表法分成两组：对照组和抑郁模型组，每组各10只。

1.2 方法

抑郁模型组采用21 d慢性不可预知温和应激法建立大鼠抑郁模型，建模期间该组每只大鼠均经7种不可预知温和应激各3次，每天1种，21 d完成建模。7种应激分别为：禁食24 h、4℃冰水浴中游泳5 min、束缚限制行动2 h、禁水24 h、昼夜跌倒、高空（离地面1 m）悬尾10 min、脚底电击2次（800 mA持续1 s，每10 秒电击1次）。对照组大鼠不接受任何应激，自由摄食饮水。

1.3 抑郁行为评定

1.3.1 糖水消耗实验  将每只大鼠单笼饲养。建模应激前和应激后各测1次，每次3 d。第1天每只大鼠给予1%蔗糖水2瓶（200 mL/瓶）进行训练;第2天将其中1瓶1%蔗糖水换成等量自来水;第3天禁水23 h，然后给予200 mL的1%蔗糖水和自来水各1瓶，1 h后，分别测定各瓶所剩蔗糖水或自来水的体积，即可得出每只大鼠1 h内饮用蔗糖水和自来水的量，并根据以下公式计算糖水消耗率。糖水消耗率=糖水消耗量/（糖水消耗量+自来水消耗量）×100%。

1.3.2 旷场实验  建模应激前与应激后各测定1次。采用诺达斯行为学系统进行测定，Etho Vision XT软件进行分析。旷场实验容器的长宽高分别100 cm×100 cm×40 cm，内壁黑色，将底部分为20 cm×20 cm面积相等的25格，容器正上方装有摄像头记录动物的行为轨迹。将大鼠放入容器中央，纪录5 min内水平得分和垂直得分。水平得分定为大鼠至少有3只爪子进入容器底同一个20 cm×20 cm面积格子的次数，垂直得分定为大鼠两只前爪离地或两只前爪攀附桶壁的次数。旷场实验在安静黑暗环境进行，每测试完1只大鼠，均清理大鼠排泄物，并用70%酒精擦拭去除可能留下的味道。

1.4 腦脊液、中缝核组织的取材

在大鼠麻醉后，在大鼠头颈部切一约2 cm的纵行切口，钝性分离颈部背侧肌肉，暴露枕骨大孔，将大鼠头高脚低固定，用1 mL注射器将针头由枕骨大孔刺入，小心抽取脑脊液约0.1 mL。然后断头处死大鼠，分离中脑置于冰上，迅速切取中缝核。脑脊液和中缝核置-80℃冰箱保存待测。

1.5 中缝核SERT蛋白测定

采用Western blot法测定，参照Baudry A等[9]方法进行。首先，使用膜蛋白提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）提取中缝核膜蛋白，并且通过Bradford法对蛋白进行定量。抗SERT一抗，抗β-actin一抗以及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Santa Cruz公司（加拿大）。结果分析使用ChemiDoc TM XRS+系统（美国Bio-rad公司），并将其与β-actin进行校正。

1.6 脑脊液和中缝核miR-16测定

采用实时荧光定量PCR法测定。首先，提取脑脊液、中缝核总RNA（北京天根生化科技有限公司），取2 μg RNA进行反转录获得cDNA，随后进行实时荧光定量PCR扩增。目的基因miR-16的上游引物与其本身序列一样，为5-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3。将U6做为校正基因，上游引物序列为5-ACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-3。miR-16与U6的下游引物相同，由试剂盒自带[miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒（SYBR Green），北京天根生化科技有限公司]。PCR扩增程序为：94℃预变性 2 min，94℃变性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次。根据扩增曲线获得Ct值，并将其用对应的U6值进行校正。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件分析数据。糖水消耗率、旷场实验水平得分垂直得分、脑脊液miR-16、中缝核miR-16、中缝核SERT水平为计量资料，对照组与模型组之间的比较采用独立样本t检验;脑脊液miR-16、中缝核miR-16、中缝核SERT水平为连续型计量资料，其相关性分析采用Pearson相关分析。检验水准设为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑郁行为学指标结果

应激前，对照组和模型组糖水消耗率比较，差异无统计学意义（P>0.05），对照组和模型组之间旷场实验水平得分和垂直得分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。应激后，模型组大鼠糖水消耗率明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。旷场实验中，模型组的水平得分和垂直得分分别与对照组比较，均表现出较低的水平，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 miR-16和SERT水平比较

脑脊液miR-16比较：模型组miR-16水平明显低于对照组，差异有统计学意义（t=3.83，P=0.001）。中缝核miR-16比较：模型组miR-16水平显著低于对照组，差异具有统计学意义（t=3.00，P=0.008）。中缝核SERT比较：模型组SERT水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（t=3.71，P=0.002）。见表2。

表2   脑脊液与中缝核miR-16或SERT测定结果比较（x±s）

2.3 脑脊液miR-16与中缝核miR-16的相关性

脑脊液miR-16和中缝核miR-16之间存在明显的正相关关系（对照组r=0.69，P=0.03;模型组r=0.95，P=0.000），见图1。

2.4 中缝核miR-16与中缝核SERT蛋白表达的相关性

对照组的中缝核miR-16水平与該组织的SERT蛋白之间有显著负相关（r=-0.62，P=0.04）;同时，模型组的中缝核miR-16水平与该组织的SERT蛋白之间也有明显的负相关（r=-0.85，P=0.002）。见图2。

2.5 脑脊液miR-16与中缝核SERT蛋白的相关性

脑脊液miR-16与中缝核SERT呈显著负相关（对照组r=-0.89，P=0.000;模型组r=-0.91，P=0.000），见图3。

3 讨论

有研究显示，动物抑郁模型以及抑郁患者自杀后的脑组织中miRNAs的表达发生了改变，提示miRNAs参与了脑组织的发育与功能发挥[12，13]。如Smalheiser NR[13]指出，与健康对照比较，无药物治疗史的抑郁症患者脑组织miRNAs呈现全面下降，几乎每个患者均有约17%的下降。

脑脊液由脉络丛产生，分泌至脑室和蛛网膜下腔，其成分变化可能反映脑组织中某些物质的变化，并可能作为某些疾病的生物标志物[14-17]。例如，脑脊液中神经丝蛋白轻链水平可提示神经系统疾病的神经元死亡和轴突退行性病变[18]。另外，研究者指出，脑脊液中某些蛋白质可作为抑郁症的生物标志物，如非编码的长RNA[19]、14-3-3蛋白[20]、脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）[21]和某些miRNAs[22]等。其中，脑脊液miR-16在抑郁症患者脑脊液中显著低于健康正常人，提示脑脊液miR-16可能与抑郁症十分相关[11]。但是，脑脊液miR-16能否反映抑郁症脑组织中的miR-16水平并作为生物标志物，目前尚未有相关报道。

miR-16对5-HT系统的影响主要是miR-16对SERT基因表达的调节，从而造成突触间隙5-HT水平的改变[23-25]。2010年，Baudry A等[9]在Science上首次发表论文称，1C11神经内分泌细胞系分化成分泌去甲肾上腺素的细胞系（1C11NE）后，其miR-16表达水平比分化成分泌5-HT的细胞系（1C115-HT）低，该现象造成了1C11NE细胞系SERT合成增加[7]。人肺癌上皮细胞A549细胞系实验亦揭示，miR-16以SERT为靶基因，通过下调该基因的表达而影响5-HT递质转运系统[26]。后来，Moya PR等[27]在人胎盘绒膜癌细胞系JAR细胞以及大鼠中缝核神经元细胞系RN46A细胞中亦发现miR-16对SERT蛋白表达的调节作用。

中缝核因聚集5-羟色胺能神经元，其主要功能是产生递质5-HT[28]，有文献报道，5-HT重吸收的选择性抑制剂通过提高中缝背核细胞外的5-HT水平，有明显的抗抑郁效果，已被广泛用于抗抑郁治疗[29]。氟西汀是临床上常用的抗抑郁药，其疗效机制为抑制SERT的功能，增加突触间隙的5-HT浓度，从而增强脑组织5-HT功能，产生其药理作用。研究发现，将氟西汀注入中缝核，与注射前比较，发现了该区miR-16的升高以及SERT蛋白的降低[9]，提示氟西汀抑制SERT功能有可能通过中缝核miR-16介导。另外，向大鼠中缝核注入miR-16，可观察到抑郁模型小鼠抑郁样行为的改善现象[9]。由此可见，中缝核是miR-16调节SERT蛋白的表达的重要部位，而且，miR-16可能通过影响中缝核5-HT功能发挥其在抗抑郁药疗效以及抑郁症发病机制中的作用。

本次实验建立大鼠抑郁模型，测定了脑脊液miR-16、中缝核miR-16以及中缝核SERT水平，将其与对照组进行比较，并分析三者的关联性，结果表明，脑脊液miR-16、中缝核miR-16均低于对照组，而中缝核SERT高于对照组。另外，脑脊液miR-16与中缝核miR-16呈显著正相关，并且脑脊液miR-16与中缝核miR-16一样，与中缝核SERT蛋白水平呈显著负相关。本次实验结果进一步支持Baudry A等[9]在Science发表的观点。

本研究存在的不足：一、未探索抑郁模型大鼠脑脊液miR-16水平改变的可能原因;二、根据前期的研究报道以及我们团队的研究结果，本次实验只分析了脑脊液miR-16与中缝核miR-16、SERT的相关性，未对脑脊液与其他脑组织的相关性进行分析。

综上所述，脑脊液miR-16水平可反映中缝核miR-16水平，进而与中缝核SERT基因表达相关，并且其有望作为抑郁症的生物标志物之一。

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（收稿日期：2018-07-05）