血液中常见除草剂的UPLC-HRMS分析

杨 杨，张晓光，于 峰，施 妍，秦晓欣，苗鑫刚，董 玫，文 迪，马春玲

（1.河北医科大学法医学院 河北省法医学重点实验室 河北省法医分子鉴定协同创新中心 河北医科大学法医鉴定中心，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学医学与健康研究院 大型仪器设备共享服务平台，河北 石家庄 050017；3.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；4.石家庄市公安局物证鉴定所，河北 石家庄 050000）

除草剂在现代农业生产过程中应用广泛，其生产量和使用量逐年增加。目前我国常见的除草剂包括季铵盐、有机磷、酰胺、磺酰脲及三氮苯等10余种类型[1-5]。同时，由误服、投毒、自杀等引起的中毒案件也随之增多[6]，对血液中除草剂进行快速准确的定性筛选和定量分析对相关案件的侦破及临床中毒患者的诊治意义重大[7-8]。目前生物检材中除草剂的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法和免疫分析法[9-12]等。由于除草剂种类繁多、性质多样，故样品前处理和仪器分析方法不一，现有文献报道的方法多仅适用于性质类似的除草剂筛选[13-15]。

本研究选取5类10种常见除草剂，基于蛋白沉淀前处理方法及超高效液相色谱-高分辨质谱法（ultrahigh performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，UPLC-HRMS）联用分析，以建立一种稳定、快速、灵敏的定性定量分析方法，并将其应用于实际案例。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

百草枯、敌草快、草甘膦、草铵膦、氰草津、莠去津、吡草胺、乙草胺、氯磺隆、甲磺隆标准品（1mg/mL的水或甲醇标准溶液）均购自上海市农药研究所有限公司，乙腈、甲醇（色谱纯）购自美国Thermo Fisher Scientific公司，甲酸（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）均购自北京DiKMA公司，实验用水均为Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备的超纯水。

Q ExactiveTMFocus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪、UltiMateTM3000高效液相色谱仪（美国Thermo Scientific公司），高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），旋涡振荡器（美国Corning公司），KQ-500DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 溶液配制

混合标准物质储备液：分别精确吸取10 μL 1mg/mL的百草枯、敌草快、草甘膦、草铵膦、氰草津、莠去津、吡草胺、乙草胺、氯磺隆、甲磺隆标准物质于容量瓶中用甲醇定容至10mL，得到质量浓度为1μg/mL的混合标准物质储备液，储存于4℃冰箱中。

混合标准物质工作液：取1μg/mL混合标准物质储备液，用流动相逐级稀释后配制成质量浓度分别为500、100、50、20、10、5、1和0.5ng/mL的混合标准物质工作液。

1.3 样品前处理

取血液样品200μL，加入乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1] 800 μL，充分混匀并涡旋 1 min，超声5min后，在4℃下以离心半径8.5cm，12000r/min，离心10 min，取上清液经0.2 μm滤膜过滤，待UPLCHRMS分析。

1.4 色谱及质谱条件

1.4.1 色谱条件

Hypersil GOLDTMC18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），HyperREZ XP保护柱（3.0 mm×5.0 mm，1.9μm），均购自美国Thermo Scientific公司。柱温为室温。流动相A：0.1%甲酸溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱条件：0～6.5min，95%A；6.5～10.5min，5%A；10.5～12min，95%A。流速为0.3mL/min，进样量为1μL。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源；电喷雾电压为3 200 V；毛细管温度为320℃；辅助加热器温度为300℃；鞘气和辅助气为氮气（流速分别为30L/min、15L/min）；数据扫描方式为正负切换的全扫描/实时二级质谱扫描（Full MS/dd-MS2）模式，一级全扫描（m/z50～750）分辨率为70000，二级扫描（dd-MS2）分辨率为17500。通过连续注射分析质量浓度为1μg/mL的除草剂标准品，获得各目标物的一级和二级离子，相关UPLC-HRMS参数见表1。

表1 10种除草剂的UPLC-HRMS参数

1.5 方法学验证

对所建立的方法进行方法学验证，包括线性、检出限、定量限、准确度、精密度、提取回收率和基质效应。

线性、检出限和定量限：取空白血液样品，添加10种除草剂混合标准物质溶液，配制成质量浓度为500、100、50、20、10、5、1和0.5 ng/mL的加标样品，按照1.3节方法进行样品前处理，以每个目标物质量浓度为横坐标（x），以提取的一级定量离子峰面积为纵坐标（y），用加权最小二乘法进行回归运算，求得线性方程，以信噪比≥3时对应的标准物质质量浓度为检出限，信噪比≥10时对应的标准物质质量浓度为定量限。

准确度、精密度和提取回收率：选取空白血样，分别精确添加不同质量浓度的10种除草剂混合标准物质溶液，配制成低浓度（1倍定量限）、中浓度（2倍定量限）、高浓度（10倍定量限）3个浓度水平的质量控制样品，每个浓度水平平行测定6份，按1.3节的方法处理后，在1.4节的色谱和质谱条件下进行检测，连续检测3 d，计算方法的准确度、日内精密度、日间精密度；空白加标血样峰面积带入拟合标准曲线中计算回收率。

基质效应：由于血液样品基质较为复杂，分析物以外的成分会对分析物质有一定的干扰，从而影响分析结果的准确性[16]。为评价本方法的基质效应，首先按1.2节的方法配制10种除草剂的混合标准物质溶液，得到各物质拟合的线性回归方程斜率，记为k0，取一定量的空白样品，按照1.3节的样品前处理方法制得空白基质溶液，用空白基质溶液配制10种除草剂的混合标准物质溶液，测定得到各物质拟合的线性回归方程斜率记为k，基质效应（M）通过公式M=k/k0-1进行计算[16-17]。

2 结 果

2.1 前处理方法的选择

目标物萃取是分析方法中至关重要的步骤。由于除草剂种类繁多、性质多样，常规样品预处理方法（如液-液萃取和固相萃取）较难满足同时对多种类型除草剂进行筛选和定量检测的需求。本研究选择用蛋白沉淀法对血样进行前处理，虽然方法检出限与液-液萃取和固相萃取法相比较高，但操作简便、成本低，尤其是可同时提取血液中10种除草剂，以备后续的UPLC-HRMS筛选分析。

乙腈与不同比例的水混溶后，其极性更有利于提取多种化合物。此外，当样品溶剂与流动相的洗脱强度有差异，尤其是前者洗脱强度较强时，就会产生峰形和柱效的降低。基于此，我们在预实验中分别用纯乙腈、乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=1∶1]、乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=2∶1]、乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1]对空白加标样品进行处理，结果发现在样品中加入乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1]做沉淀剂时，蛋白沉淀效果良好，且色谱峰形最优，目标物回收率最高。

2.2 质谱条件的优化

首先使用蠕动针泵以10μL/mL的流速将10种化合物直接注入质谱仪中，确定每种除草剂的一级质谱离子和二级质谱离子的精确质量数，然后连接液相部分，对质谱离子源的参数进行优化，在一定范围内（15～50 L/min）改变鞘气和辅助气的流量，通过观察10种化合物的出峰情况，选择最佳参数。当鞘气和辅助气的流速分别为30L/min和15L/min时，质谱离子化效应最强，灵敏度最高。比较了不同分辨率（35000、70 000、100 000）下一级质谱图和二级质谱图的出峰情况，发现使用100000分辨率进行扫描得到的质谱峰面积最小，灵敏度下降。而设置成35000分辨率时目标物质出峰面积变大，仪器噪声变大，检出限降低。综合考虑，将一级全扫描分辨率设置为70 000，其他质谱参数经系统软件自动优化。

2.3 色谱条件的优化

本实验分别使用了10 mmol乙酸铵水溶液-乙腈、10 mmol乙酸铵水溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇3种流动相体系，按照1.4节的梯度洗脱程序，以100ng/mL的混合标准物质进样，通过比较10种化合物的出峰情况选择最优的流动相体系。结果以0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相时，10种化合物的出峰情况良好，峰形窄且对称，与使用10 mmol乙酸铵水溶液-乙腈、10mmol乙酸铵水溶液-甲醇作流动相相比，灵敏度更高。这可能与本研究中大部分目标物母离子均是正离子模式出峰，流动相中加入甲酸比加入乙酸铵更能增大其离子化效应有关。因此，本方法选择0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相。

2.4 方法学验证

百草枯、敌草快、草甘膦、草铵膦、氰草津、莠去津、吡草胺、乙草胺、氯磺隆、甲磺隆的保留时间分别为 1.84、2.30、2.19、2.31、5.65、6.16、6.46、7.37、5.17、5.07min，其提取离子色谱图见图1。上述除草剂在各自线性范围内线性关系均良好，决定系数（R2）均大于0.993，测定值的相对标准偏差为1.5%～10.8%，日内精密度为2.7%～13.5%，日间精密度为3.3%～13.3%，平均回收率为67.4%～111.9%，准确度为85.1%～106.1%。10种化合物的线性方程、检出限见表2，回收率、准确度和精密度见表3。

图1 10种化合物的提取离子色谱图

表2 10种化合物的线性方程、检出限和定量限

表3 10种化合物的回收率、准确度和精密度 （%）

续表3

如表2所示，草甘膦、氯磺隆等7种物质的基质效应在±0.20之间，但百草枯、敌草快、莠去津的基质效应较大。因此，在实际案例应用中，一定要在同种基质中进行加标回收以消除基质效应的影响。

2.5 案例应用

将本研究所建方法于2018年1月—2018年5月在河北医科大学法医鉴定中心实际案例中进行应用，对10名可疑除草剂中毒者血液中的除草剂成分进行定性定量分析，其中6名为女性，4名为男性，年龄16～47岁，均为口服自杀。结果检出百草枯中毒7例（0.09～78.48μg/mL）、草甘膦中毒1例（0.79μg/mL）、莠去津中毒1例（4.73 ng/mL）、乙草胺中毒1例（10.57 ng/mL）。上述案例中，7例百草枯中毒者均死亡，死者血液中百草枯质量浓度均在致死血质量浓度（0.05μg/mL[18]）以上，其余3例除草剂中毒者经临床抢救治疗均存活。

3 结 论

本研究建立了血液中常见除草剂的筛查方法，以乙腈-水溶液[V（乙腈）∶V（水）=3∶1]为蛋白沉淀剂对血样进行处理后，采用UPLC-HRMS法进行检测。本方法稳定、快速、灵敏、准确度高，可同时对血液中多种类型除草剂进行快速准确的定性筛查和定量分析，对相关案件的侦破及临床中毒患者的诊治具有重要意义。