1株产嗜热酯酶菌株的分离、鉴定及酯酶部分酶学性质分析

毕文慧，姚 健，陈庆隆，马吉平，王洪秀

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所，江西 南昌 330200；2.山东农业工程学院 食品科学与工程学院，山东 济南 250100)

酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)又称羧酸酯酶，是一种多聚蛋白，可催化酯类中羧酸酯键的裂解，广泛存在于动物、植物及微生物体内[1-6]。酯酶可与多种底物特异性结合，反应具有可逆性，可催化底物的水解反应及合成反应，具有较高的区域选择性或对映选择性[7-8]，其作为一种重要的工业酶类，广泛应用于农业、食品、医药、化工等领域[9-10]。利用微生物发酵生产酯酶是工业化酯酶生产的重要途径，自然界中产酯酶微生物种类繁多、分布广泛，从不同生境中筛选各类产酯酶菌株可扩展酯酶种类，扩大应用范围[6，8]。国内外研究人员已从真菌(黑曲霉、黄曲霉、红曲霉、根酶、青霉及酵母等)、细菌[1，7-12](芽胞杆菌属、假单胞杆菌属等)及放线菌[13-15]中筛选得到多种产中温酯酶微生物。但中温酯酶在使用中存在局限性，在一些高温化学反应中无法应用，且催化效率、底物专一性、生物稳定性均无法与嗜热酯酶相比。本研究从某沼气站堆肥发酵周边的土壤中筛选到了1株嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，对该菌株进行了鉴定，并对其产酶条件及酶学性质进行初步探讨，结果发现该菌产生的酯酶为嗜热酯酶，其最适反应温度为75 ℃。在75 ℃条件下处理12 h，其酶活性没有明显的变化，说明该酶具有极高的温度稳定性，70%(体积分数)的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亚砜、乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂对酯酶活性均有激活作用，该酯酶的温度稳定性及有机溶剂耐受性可应用于工业生产过程中，并为进一步克隆嗜热酯酶基因提供了微生物菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 用于产酯酶菌株的分离样品来源于某沼气站堆肥发酵周边的土壤(夏季采集样品)。

1.1.2 所用试剂 对硝基苯酚乙酸酯(pNPC2)、对硝基苯酚丁酸酯(pNPC4)、对硝基苯酚己酸酯(pNPC6)、对硝基苯酚辛酸酯(pNPC8)和对硝基苯酚癸酸酯(pNPC10)，对硝基苯酚月桂酸酯(pNPC12)和对硝基苯酚均购自sigma公司，Taq酶和连接酶购于TaKaRa公司。

1.1.3 培养基(g/L) 筛选培养基[10]：牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,三丁酸甘油酯 5,琼脂 20,pH自然,121 ℃灭菌15 min。液体培养基：牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 10,pH自然，121 ℃灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 酯酶产生菌的分离 用无菌水对土壤样品进行梯度稀释后涂布于筛选培养基上，30 ℃培养3～5 d，挑取具透明圈的菌落，再次接种到筛选培养基上，反复多次划线纯化直到获得纯培养物。分别测量单菌落水解圈直径与菌落直径，两者比值(HC值)越大表示其水解三丁酸甘油酯能力越强，筛选5株HC值最大的菌株。

1.2.2 酯酶高产菌株的筛选 将初筛筛选到的菌株接种到10 mL液体培养基中，30 ℃、160 r/min条件下培养48 h，测定发酵液中的酶活力。

1.2.3 菌株鉴定 ①形态观察：将筛选到的菌株活化后接种于筛选平板上，37 ℃下培养2 d，观察菌落形态。 ②菌株的生理生化鉴定：参照文献[16]进行。菌株对葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖的利用：在液体培养基中分别加入葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖，30 ℃条件下培养2 d，每隔4 h分别取样检测培养基中葡萄糖、乳糖、木糖和蔗糖的利用情况。H2O2酶、纤维素酶及淀粉酶活性检测：取经液体培养的发酵液，分别以H2O2、羧甲基纤维素及可溶性淀粉为底物，检测H2O2酶，纤维素酶及淀粉酶活性。③16S rDNA序列分析：参照姚健等[17]的方法。利用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，以基因组DNA为模板，27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(3′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-5′)为引物进行PCR扩增，PCR产物经纯化后与pMD-18T载体连接，转入大肠埃希菌，培养后送测序公司进行测序。序列提交至NCBI数据库中进行Blast软件序列比对，用MEGA5.0软件采用邻接法构建系统发育进化树。

1.2.4 酶活测定 ①对硝基苯酚标准曲线的制作：用蒸馏水将5 mmol/L硝基苯酚(溶解于乙醇中)稀释成不同浓度(0.3、0.6、 0.9、 1.2和1.5 mmol/L)；向各离心管中分别加入90 μL 100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和10 μL上述不同浓度的对硝基苯酚，75 ℃保温10 min，然后加入50 μL 2 mol/L 的Na2CO3，冰上放置20 min，5 000 g离心5 min后，在405 nm波长下测吸光度，用蒸馏水代替对硝基苯酚作为空白进行调零。以吸光值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，制作标准曲线。②酯酶活力的测定：将筛选到的菌株接种于液体培养基培养，12 000 g离心5 min后取上清液作为粗酶液。参照文献[17]的方法稍作修改测定酯酶活力。取10 μL粗酶液，加入80 μL 100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和10 μL 20 mmol/L硝基苯酚丁酸酯(溶解于乙醇中)，75 ℃保温10 min，加入50 μL 2 mol/L 的Na2CO3终止反应，冰上放置20 min，5 000 g离心5 min，取上清，在405 nm波长下测吸光度。

空白对照：取80 μL 100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和10 μL 20 mmol/L硝基苯酚丁酸酯(溶解于乙醇中)，加入50 μL 2 mol/L 的Na2CO3和10 μL 100 ℃处理30 min的酶液，75 ℃保温10 min，冰上放置20 min，5 000 g离心5 min，取上清，在405 nm波长下测吸光度；1个酶活力单位定义为1 min释放1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量。蛋白浓度利用Bradford方法检测。

经测定，对硝基苯酚的标准曲线解析式为A405=0.146 6C，R2=0.998，C为对硝基苯酚的浓度(mmol/L)，根据此解析式可计算产物生成量，由酶活定义换算成酶活力公式：

酶活力(U/mg)=

式中：0.342 mg/mL为粗酶液中蛋白质量浓度。

1.2.5 酶学性质研究 ①酶的底物特异性:取10 μL粗酶液，加入10 μL 20 mmol/L不同碳链长度的对硝基苯酚酯类物质，按照1.2.4方法测定酶活性，以确定酶的最适反应底物。②酶的最适反应温度及温度稳定性：按1.2.4方法，以35 ℃为起始温度，每升高5 ℃测定1次粗酶液的酯酶活性，直到90 ℃为止；另外，将粗酶液分别在上述不同温度条件下放置12 h，然后检测粗酶液在最适反应条件(最适pH、最适温度)下的温度稳定性，以4 ℃放置的粗酶液的酶活性定义为100%。③酶的最适反应pH：取10 μL粗酶液，将反应体系的pH分别用100 mmol/L醋酸盐缓冲液调整至pH 4.0～6.0、100 mmol/L磷酸盐缓冲液调整至pH 5.5～8.0、100 mmol/L Tris-HCl缓冲液调整至pH 7.5～9.0，然后在最适反应温度下按1.2.4方法测定粗酶液的酯酶活性。④金属离子及有机溶剂对酶活性的影响：取90 μL粗酶液，分别加入10 μL 0.2 mol/L的金属离子(Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+和Na+)，室温放置30 min后在最适反应条件下测剩余酶活性。取100 μL粗酶液，分别加入有机溶剂(甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亚砜、乙醇、异丙醇和丙酮)，使其终浓度为70%，室温放置30 min后在最适反应条件下测剩余酶活性，以未加金属离子及有机溶剂的酶活定义为100%。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选及鉴定

利用三丁酸甘油酯选择培养基从土壤样品中分离筛选到了10株能产生透明圈的菌株，根据HC值的大小，选择5株进行液体培养复筛。其中1株菌株产生的酯酶具有较高的温度稳定性，因此选定其做进一步的鉴定，并将其命名为YJ 1-1。

2.2 菌株YJ 1-1的鉴定

菌株YJ 1-1在固体培养基上37 ℃培养48 h，菌落呈灰黄色，表面湿润且较黏稠，边缘整齐。显微镜下个体形态为杆状，经革兰染色发现该菌株为阴性菌，严格需氧，H2O2酶阳性，纤维素酶及淀粉酶均为阴性。另外，该菌株在生长过程中能够利用葡萄糖、乳糖和木糖，但不能利用蔗糖。

16S rDNA测序发现片段序列长为1 420 bp，将序列提交至GenBank，登录号为 KX863515，对菌株YJ 1-1的16S rDNA序列分析表明，该菌株与多株嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)16S rDNA 的相似性为99%，结合其形态及生理生化特征，将菌株YJ 1-1初步鉴定为嗜麦寡养单胞菌，命名为StenotrophomonasmaltophiliaYJ 1-1。其系统发育树见图1。

2.3 酯酶酶学特性分析

2.3.1 酯酶的底物特异性 用100 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)分别配置6种底物溶液(pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8、pNPC10和pNPC12)，然后加入酶液，在50 ℃条件下测定酶活力(在75 ℃和pH 7.0条件下，酯酶对对硝基苯酚丁酸酯(C4)的最高酶活为100%)，结果如图2 所示，pNPC4作为底物时的相对酶活力最大，pNPC2作为底物时的相对酶活力次之，pNPC8、pNPC10和pNPC12作为底物时的相对酶活力很低，表明菌株StenotrophomonasmaltophiliaYJ 1-1产生的胞外蛋白均为酯酶，而非脂肪酶。

图1 菌株16S rDNA的系统进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree of strain based on 16S rDNA sequence homology

图2 嗜热酯酶对不同底物反应特异性析Fig.2 Analysis of different substrates hydrolyzed by the thermophilic esterase

2.3.2 pH及温度对酶活性的影响 以对硝基苯酚丁酸酯为底物测酯酶活性(以对硝基苯酚丁酸酯为底物，在75 ℃、pH 7.0下测得的酶活作为100%)，如图3所示，随着pH的升高，酯酶活性逐步升高，在pH 7.0时，StenotrophomonasmaltophiliaYJ 1-1酯酶活性达到最高值，之后活性逐渐下降，故其最适反应pH为7.0；在温度低于45 ℃时，随着温度的升高，酯酶的酶活性迅速提高；其后随着温度的升高，酯酶活性缓慢升高，当温度升高到75 ℃时，酶活性达到最高值；其后随着温度的升高，酯酶活性迅速降低，当温度升高到85 ℃时，酯酶的酶活性仅为最高值的10%左右，故StenotrophomonasmaltophiliaYJ1-1酯酶的最适反应温度为75 ℃ (图4)。此外，该酶在50～75 ℃条件下，均能保持很好的稳定性，说明该酶在75 ℃时酶活力高而且稳定，是一个极其稳定的嗜热酶(图5)。

图3 pH对嗜热酯酶活性影响Fig.3 Effects of pH on activity of thermophilic esterase

图4 温度对嗜热酯酶活性的影响Fig.4 Effects of temperature on activity of thermophilic esterase

2.3.3 金属离子及有机溶剂对酶活性的影响 如表1所示，Mg2+及Na+对酯酶有激活作用，Cu2+、Zn2+和Fe3+对酯酶活性有抑制作用。体积分数为70%的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亚砜、乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂对酯酶活性均有激活作用，分别使酯酶活性提高了2.30、4.65、2.05、1.30、5.02、1.74、1.09和2.12倍。

图5 温度对嗜热酯酶稳定性的影响Fig.5 Effects of temperature on stability of thermophilic esterase

表1 金属离子和有机溶剂对酯酶活性的影响Table 1 Effects of chemicals on activity of esterase

3 讨 论

与化学催化剂及中低温酯酶相比，嗜热酯酶可以在高温条件下保持很好的稳定性，使很多高温化学反应得以稳定进行；同时在生产过程中，嗜热酯酶催化的化学反应对反应器冷却系统的要求标准降低，这一方面减少了能耗，另一方面也降低了冷却过程造成的环境污染。近年来，人们已从嗜热微生物中分离得到多种嗜热酯酶，如Asoodeh等[19]从热泉中筛选到了1株产嗜热酯酶的海洋斯瓦尼氏菌88，其生产的酯酶的最适反应温度为58 ℃。解秋桂等[20]研究了古细菌AeropyrumpernixK1所产酯酶的稳定性，发现其90 ℃的半衰期为12 h。Zhang等[4]研究了来源于Sulfobacillusacidophilus的酯酶特性，研究表明该酯酶的最适反应温度为70 ℃，在该温度下处理10 min，剩余酶活性仅为原来的30%。来源于Actinomadurasp.的酯酶在80 ℃条件下处理60 min，已完全丧失其酶活性[21]。Gao等[22]利用宏基因组学从海底淤泥中筛选到酯酶，对丙酮及异丙醇都有一定的耐受性，但对甲醇及乙醇的耐受性较差，经50%的甲醇及乙醇处理后，其剩余酶活性仅为23.2%和0.5%。本研究从某沼气站堆肥发酵周边土壤样品中分离筛选到了1株嗜麦寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，该菌生产的酯酶是一种嗜热酯酶，其最适反应温度为75 ℃，最适反应pH为7.0，且该酶表现出极强的温度稳定性，在75 ℃处理12 h，其酶活性没有明显变化。70%(体积分数)的甲醇、二甲基甲酰胺、丙三醇、正丙醇、二甲基亚砜、乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂对酯酶活性均有激活作用，分别使酯酶活性提高了2.30、4.65、2.05、1.30、5.02、1.74、1.09和2.12倍，并且该酯酶具有较高酶活性(0.981 U/mL或2.87 U/mg)，明显高于摩氏摩根菌 ZJB-09203 酯酶的活性(0.18U/mg)[23]。另外，陈静等[24]从肉牛瘤胃液中分离到1株产酯酶的大肠埃希菌RB1，酶活性检测显示在以对硝基苯酚乙酯为底物时，其酯酶的最高酶活性为0.52 U/mL，上述特征表明该酯酶可应用于工业生产。