响应面分析法优化竹叶蛋白质提取工艺

范 煜，王鑫宁，张 强，蒋立新，吴良如，陈 颖，何经晟，肖竹钱，葛 青，毛建卫，胡林福

（1.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室 浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江 杭州310023；2.国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州310012；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州313399）

竹子是禾本科竹亚科多年常绿植物，为现今世界上最具有利用价值的植物类型之一。截止目前，全世界记录在册的约有70属1 200多种竹子，广泛分布于东南亚、印度、南美等地［1］。中国有“竹子王国”之称，尤其是在江浙地区，竹种类繁多，适宜的气候为竹的生长提供了优异的生长环境。浙江地区尤以毛竹种植面积为最，仅安吉一县毛竹林就达5.6万hm2，是当地最重要的经济林。竹子不同部位均有较高的食用、药用及商用价值［2］，以竹叶、竹鞭根、竹衣、竹茹、竹沥、竹棒、竹秆、竹黄、竹膏和竹笋等为原料开发的产品广泛应用于食品、医药、建筑、手工业和造纸业等领域［3－4］。

竹类资源的研究十分活跃，开发利用竹叶资源，提取竹叶中有效生物活性物组分，已成为人们研究的重点之一［5－9］。据报道，竹叶提取物中含有多酚、黄酮、多糖、蛋白质及氨基酸等与人体生命活动有关的活性物，竹叶提取物具有广泛的药用价值［10－11］。随着中国人口增加，食品资源逐步趋于紧张，功能性植物蛋白质资源更是贫乏。将大量廉价的竹叶蛋白质资源转化为优质蛋白质以及功能性保健品，具有重要的社会和经济意义［12］。

竹叶中含有较多竹叶蛋白，毛燕等［13］对毛竹的化学成分进行了初步分析，毛竹叶蛋白质含量在所测定的9种竹叶中仅次于最高的白哺鸡竹，达到15.38%，陈志印等［14］采用微波辅助提取优化了早竹竹叶蛋白质提取工艺，提取得率为8.07%，毛竹叶蛋白总体含量相对较高，具备较高的开发利用价值。但目前的研究多以凯氏定氮法为检测标准，以含氮量为检测指标，该方法操作过程中试样消化程度、催化剂用量、消化液转移、接收瓶处理等因素都会影响蛋白质含量的测定，结果存在较大误差［15］。该研究采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，其原理为考马斯亮蓝染液与蛋白质结合并在595 nm处得到最大吸收，较之凯氏定氮法等方法灵敏度更高。由于蛋白质在缓冲盐溶液中拥有更大的溶解度，为提高竹叶蛋白质得率，研究采用磷酸盐缓冲溶液（PBS）代替传统水提。通过单因素试验、响应面试验优化竹叶蛋白质的提取工艺，提高竹叶蛋白质实际得率，为竹叶蛋白质的工业化生产提供理论依据与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一年生风干后毛竹竹叶由浙江圣氏生物科技有限公司提供；考马斯亮蓝，甲醇，无水乙醇等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器

RHP-600型高速多功能粉碎机（浙江荣浩工贸有限公司）；KQ-500E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；MB45型水分测定仪（美国奥豪斯仪器有限公司）；UV 5500PC型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 毛竹叶原料含水率与总蛋白含量的测定 取1.5 g烘干后竹叶，通过MB45型水分测定仪，测定其含水率。

1.3.2 竹叶蛋白质的提取 取适量竹叶，经过高速粉碎机粉碎，过60目筛。将竹叶粉放入超声波提取装置中，按所设定的提取温度、时间、超声功率、料液比以及提取次数，加入适量的提取液进行超声提取。浸提结束后减压抽滤，收集滤液，测定蛋白质含量。

1.3.3 蛋白质含量及标准曲线的测定 参考考马斯亮蓝法，测定竹叶粉中水溶性蛋白质含量［14－15］。

1.4 试验设计

1.4.1 提取液的筛选 分别以去离子水、0.5 mol·L－1NaCl溶液、pH为8的Tris-HCl溶液、0.1 mol·L－1的PBS（pH＝7.4）为溶剂，液料比1∶20，于40℃水浴条件下提取竹叶蛋白质，提取时间60 min，以蛋白质得率为指标进行工艺参数优化。

1.4.2 提取竹叶蛋白质的单因素实验 根据提取液筛选结果，选用PBS缓冲溶液作为蛋白质提取的溶剂。罗秋水，刘海飞等［16－17］研究发现在0～120 W 范围内蛋白质提取得率随着超声波发射功率增大而增大，根据KQ-500E型超声波发生器可发射超声波功率范围（0～100 W），综上所述，选择超声功率为100 W。实验分别对提取时间、温度、液料比、次数和pH值这5个影响蛋白质提取效果的因素进行单因素考察。实验设定pH为7，液料比1∶20，提取温度40℃，提取时间60 min，提取1次、2次、3次、4次、5次；固定pH 7，液料比20，提取温度25℃，提取2次，提取时间采用10、20、30、40、50、60、90和120 min；固定pH 7，液料比20，提取时间90 min，提取2次，提取温度采用10、20、30、40、50℃（蛋白质在50℃以上易变性，所以最高温度设定在50℃）；固定pH 7，提取时间90 min，提取温度40℃，提取2次，液料比10、15、20、25、30；固定液料比20，提取温度40℃，提取时间90 min，提取2次，提取pH采用5、6、7、8、9，分别进行单因素实验。

1.4.3 响应面法提取竹叶蛋白质的工艺研究 通过分析单因素实验结果确定了提取时间、温度、液料比、pH 4个显著因素，使用Design-Expert 8.0软件设计响应面试验，试验因素与试验水平见表1［18］。

表1 Box-Behnken实验设计因素与水平值Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.4.4 数据处理方法 采用Orgin和Design-Expert 8.0软件进行实验数据的图表和数据处理与分析。使用Box-Behnken方法对提取工艺进行优化。

2 结果与讨论

2.1 毛竹叶含水率及竹叶总蛋白含量

通过MB45型水分测定仪，测定得到干燥毛竹叶中含水率为9.48%，RSD＝0.38%。

2.2 蛋白质标准曲线的制作

试验以牛血清蛋白标准品作为对照，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。以吸光度A为纵坐标，标准液取样量（mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到方程y＝0．1433x＋0．00615。R2＝0．999 55。

2.3 优化提取液选择

分别以去离子水、0.5 mol·L－1NaCl溶液、pH为8.0的Tris-HCl溶液、0.1 mol·L－1的PBS（pH＝7.4）为溶剂对竹叶蛋白质进行提取，结果如图2所示。根据提取率可知，0.1 mol·L－1PBS缓冲液（pH＝7）提取得到的提取液中蛋白质含量最高，以其为最佳提取液，进行下一步实验。

2.4 竹叶蛋白质提取的单因素实验结果分析

2.4.1 提取次数的影响 提取次数对竹叶蛋白质提取得率的影响如图3所示。由图3可知，提取次数小于等于2时，随着提取次数增加，蛋白质得率急剧增加；其后随着提取次数进一步增加，蛋白质得率缓慢增加。由于随着提取次数增加，原料中蛋白质含量降低，导致蛋白质得率增加的幅度降低。提取次数增加会加大生产成本。因此，综合各方面因素考虑，最佳提取次数为2次。

2.4.2 提取时间的影响 提取时间对竹叶蛋白质得率的影响如图4所示。由图4可知，随着提取时间的增加，蛋白质得率逐渐上升；提取时间超过60 min后，曲线趋于平缓。这可能是因为蛋白质在缓冲溶液中溶解速度较快，水溶性蛋白质几乎全部溶出，继续延长提取时间对其溶解量无明显影响，只能增加其分子热运动的程度，所以最佳提取时间为60 min。

图1 蛋白质标准曲线Fig.1 Protein standard curve

图2 不同提取液提取效果Fig.2 Effects of various extract solvents on the extraction rate of protein

图3 提取次数对竹叶蛋白质提取得率的影响Fig.3 Effects of extraction times on extraction rate of bamboo leaf protein

图4 提取时间对竹叶蛋白质提取得率的影响Fig.4 Effects of extraction duration on extraction rate of bamboo leaf protein

2.4.3 提取温度的影响 提取温度对竹叶蛋白质得率的影响如图5所示。由图5可知，当提取温度在10～50℃时，随着提取温度的升高，蛋白质得率逐渐上升。在10～50℃时，随着超声时间增加，蛋白质整体能量增大，蛋白质分子势能不变，只能增加动能，此时蛋白质分子热运动相对剧烈，增加蛋白质的溶出［19］，但由于温度超过50℃蛋白质容易变性失活。因此，选择最佳提取温度为50℃。

2.4.4 液料比的影响 液料比对竹叶蛋白质得率的影响如图6所示。由图6可知，当液料比在10～20 mL·g－1时，蛋白质得率急剧增加；但是当液料比超过20 mL·g－1后，蛋白质得率增加的幅度不大。这是由于当液料比过低时蛋白质溶出一部分，提取液中蛋白质浓度升高导致浓度差降低而影响蛋白质的溶出。当液料比增大后，提取液中蛋白质浓度较低，不再影响蛋白质的溶出，所以在20～30 mL·g－1，蛋白质得率基本不变。因此最佳液料比为20 mL·g－1。

图5 提取温度对竹叶蛋白质提取得率的影响Fig.5 Effects of extraction temperature on extraction rate of bamboo leaf protein

图6 液料比对竹叶蛋白质提取得率的影响Fig.6 Effects of extract-substrate ratio on extraction rate of bamboo leaf protein

2.4.5 提取pH的影响 提取液pH对竹叶蛋白质得率的影响如图7所示。由图7可知，当溶液pH为5～6时，蛋白质得率缓慢上升，pH为6～7时蛋白质得率急剧上升达到最大值为7.95%。但随着溶液pH进一步升高，蛋白质得率反而降低。可能的原因是竹叶蛋白质在pH＝7时蛋白质发生了酸式解离，使其因为蛋白质分子之间的库仑力作用而相互排斥，增加蛋白质分子之间的距离，使蛋白质分子之间分散并被水分子包围，进而增加其水溶性。随着pH的进一步增加，溶液pH达到竹叶蛋白质分子的等电点，蛋白质分子的外部不再带有负电荷，相邻蛋白质分子之间由于没有静电排斥力而产生团聚现象，导致蛋白质溶出降低。所以最佳pH为7。

图7 提取液p H对竹叶蛋白质提取得率的影响Fig.7 Effects of pH on extraction rate of bamboo leaf protein

2.5 Box-Benhnken试验结果

以单因素实验结果确定了提取时间、温度、液料比、pH 4个因素为显著因素，以Design-Expert 8.0软件进行Box-Benhnken试验设计，试验结果见表2。

如表3所示，通过Design-Expert 8.0对Box-behnken试验结果进行了分析，通过二次四元回归拟合，得到以下编码方程：

Y＝7.40－0.064A－0.10B－0.27C－0.21D＋0.18AB－0.052AC＋0.060AD－0.16BC＋0.26BD＋0.055CD－0.44A2－0.068B2－0.82C2－0.36D2

得到实际因素的回归方程：

Y＝－4.23167＋0.20267A－0.70917B＋0.18997C＋0.23417D＋0.018AB＋0.00120AD－0.00517BC＋0.0520BD－0.00437A2－0.0679B2－0.0144D2

通过软件对模型进行了方差分析。结果如表3所示，该模型的P值小于0.01，即回归模型与实际测量值拟合程度很高。显著性影响因素包括B、C、D、AB、BD、A2、C2、D2（P＜0.05），而A、AC、AD、BC、B24个因素均不显著（P＞0.05）。如表3所示，失拟项也较为显著（P值为0.036），说明回归模型与实际测量值能较好的拟合。回归模型的绝对系数R2＝95.28%，说明回归模型与实际测量值具有较高相关性，可以用此回归方程对不同条件下提取竹叶蛋白质的得率进行预测［18－19］。

各因素的F值大小可以反映试验因素对竹叶蛋白质得率的影响，F值越大，表明其对蛋白质得率的影响越大［20］。由表3可知，F（A）＝1.90，F（B）＝5.08，F（C）＝32.57，F（D）＝20.01。且F（C）＞F（D）＞F（B）＞F（A），即各因素对竹叶蛋白质得率的影响顺序为提取时间＞提取温度＞提取pH＞液料比。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Tab.2 Box-Benhnken design and experimental results

实际因素的回归方程中各影响因素系数的大小反映其对竹叶蛋白质提取得率的影响程度，系数的正负反映影响的方向［21］。由于方程的二次项系数有负值，代表3D图形抛物面开口向下，具有极大值，因此可以进行优化分析［22］。

表3 Box-Behnken试验结果方差分析Tab.3 ANOVA results of Box-Behnken experiment

利用Design Expert软件做不同因素间响应面分析图与等高线图。结果与分析见图8所示。

图8A－D反映各因素对竹叶蛋白质得率的影响。由图8－A可知，在液料比22～26 mL·g－1、pH 6～7范围内，竹叶蛋白质得率响应值可达到最佳区域，且得率随着温度及pH的增加呈现增加趋势。图8－B显示竹叶蛋白质得率随着时间的延长而呈现先增加后减小的趋势，但是幅度不大，可能原因是超声时间过长，部分蛋白质已变性。由图8－C可知，在提取液料比22～26 mL·g－1、提取温度35～45℃范围内，竹叶蛋白质得率响应值可达到最佳区域，且得率随着温度的增加呈现增加趋势。由图8－D可知，在提取温度30～40℃、提取pH 6～7范围内，竹叶蛋白质得率响应值可达到最佳区域，且得率随着温度及pH的增加呈现增加趋势。从以上4个图可知，从蛋白质得率分析，提取温度和提取时间的图形比较陡峭，说明这2个因素交互作用显著。结合以上4个响应面图形，竹叶蛋白质得率的最佳取值范围为提取温度30～40℃、pH 6～7、液固比22～26 mL·g－1、提取时间80～100 min。通过Design-Expert 8.0.6软件，计算得到蛋白质得率达到最大响应值时各因素的取值，即液料比23.39 mL·g－1、pH 6、提取温度33.17℃、提取时间87.60 min、提取2次，该条件下蛋白质理论值为7.64%。

在修正后的最优条件0.1 mol·L－1PBS缓冲溶液、液料比23.39 mL·g－1、pH 6、提取温度33.17℃、提取时间87.60 min、提取2次，该预测条件下竹叶蛋白质得率为7.64%。该条件下进行3次实验，测得竹叶中蛋白质平均含量为7.49%，比未优化前增长了24.83%，为提取竹叶蛋白质提供了较好的技术支撑。

图8 以竹叶蛋白质得率为指标的响应面图Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the yield of bamboo leaf protein

3 结论与展望

利用试验模型进行响应面分析，对实验因素及其相互作用进行探讨，各因素对竹叶蛋白质得率的影响顺序为提取时间＞提取温度＞提取pH＞液料比。优化提取竹叶蛋白质的最佳提取工艺条件为：提取2次，pH 6，33.17℃，87.60 min，23.39 mL·g－1，该预测条件下竹叶蛋白质得率为7.64%。该条件下进行3次验证实验，测得竹叶中蛋白质含量为7.49%，RSD＝3.68%，提取率为48.0%，。测得的竹叶蛋白质含量与理论值较为接近，表明数学模型对优化竹叶蛋白质提取工艺是可行的。由于提取得到的蛋白质溶液中含有较多磷酸盐，本研究课题下一步将以最优工艺条件为基础，通过透析、分子筛层析柱等除盐手段，对提取得到的竹叶蛋白质竹叶蛋白质进行分离纯化，及其结构鉴定与活性测定，为竹叶资源的开发提供一定的理论依据。