乌芪舒筋通络片的质量控制研究

谢锴标 陈震尧 吴美珠

[摘要]目的 研究乌芪舒筋通络片质量控制的可行方法。方法 采用薄层色谱法鉴别处方中的细辛、桂枝、牛大力，并采用高效液相色谱法测定处方中续断的川续断皂苷Ⅵ含量。结果 细辛、桂枝、牛大力的薄层色谱法鉴别专属性强，阴性无干扰；川续断皂苷Ⅵ的含量在491.7～1966.8 ng（r=0.9996）范围内呈良好线性关系，平均加样回收率为101.25%（n=9），RSD为1.40%。结论 定性、定量方法操作简单，重现性好，专属性强，能够有效地控制乌芪舒筋通络片的质量，可为该制剂的检验标准提供科学的依据。

[关键词]乌芪舒筋通络片；高效液相色谱法；薄层色谱法；川续断皂苷Ⅵ；质量控制

[中图分类号] R927.11 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）12（c）-0038-04

[Abstract] Objective To study the feasible method for quality control of Wuqi Shujin Tongluo Tablets. Methods TLC was used to identify Asarum， Cinnamon Twig and Niu Dali in the prescription， and HPLC was used to determine the content of Dipsacus Aspergillus saponin Ⅵ in the prescription. Results The TLC method of Asarum， Cinnamon Twig cassia and Niu Dali had strong specificity and no negative interference. The content of Dipsacus saponin Ⅵ had a good linear relationship between 491.7 and 1966.8 ng （R=0.9996）. The average recovery of sample addition was 101.25% （n=9） and RSD was 1.40%. Conclusion The qualitative and quantitative methods are easily operated and with excellent specificity and reproducibility.They can effectively control the quality of Wuqi Shujin Tongluo Tablets， and provide scientific basis for the test standard of the preparation.

[Key words] Wuqi Shujin Tongluo Tablets； HPLC； TLC； Diathesis saponin Ⅵ； Quality control

烏芪舒筋通络片是骨伤科的专科特色制剂，具有补肝肾、通络止痛的作用[1]，治疗坐骨神经痛，软组织疼痛有较好疗效。该产品是由多种中草药如制川乌、续断、细辛、牛大力、黄芪等制成的纯中药制剂，多种成分具有抗菌活性[2]。因其含有制川乌、制草乌，故常规检验中应增加乌头碱限量检测[3]。原标准为《广东省食品药品监督管理局医疗机构制剂注册标准》，只有针对防已所含的汉防已碱成分的理化鉴别、续断所含的龙胆碱成分的理化鉴别，专属性不强，质量控制方法相对落后，生产风险相对较大[4-5]，为确保本制剂安全有效，现按《广东省医疗机构制剂质量制订的技术要求》，对该制剂的质量检验进行了系统研究，建立了用薄层色谱鉴别法鉴别方中细辛、桂枝、牛大力，用高效液相色谱法测定方中续断的川续断皂苷Ⅵ含量。

1仪器与试药

1.1主要仪器

Agilent 1260-LC型液相色谱仪（美国Agilent公司），Sartorius CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司），ZF1-I型多功能紫外分析仪（上海和勤分析仪器有限公司），KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA1004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2试药

样品：乌芪舒筋通络片，规格：60片/瓶，由肇庆市中医院提供（肇庆市中医院制剂室生产），批号：15050401、15051101、15052401；对照药材：细辛（中国药品生物制药检定所，批号：121204-200803）、桂枝（中国药品生物制药检定所，批号：121191-201304）、续断（中国药品生物制药检定所，批号：121103-200806）、牛大力（中国药品生物制药检定所，批号：121209-0101）；对照药品：川续断皂苷Ⅵ，仅供测含量使用，产自中国药品生物制药检定所，批号：111685-201304；试剂：HPLG级乙腈、AR级甲醇、AR级乙醚、GR级环己烷、AR级正丁醇、GR级三氯甲烷、石油醚等；硅胶G薄层板，规格100 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm（青岛海洋化工厂、烟台市工业化学研究所），水为纯化水。

2方法

2.1鉴别方法

2.1.1细辛的薄层色谱鉴别 取乌芪舒筋通络片30片，除去包衣层。用干净的60 mm研钵研细后转移到150 ml烧杯中，加甲醇60 ml，超声预处理20 min。用快速定性滤纸过滤，滤液真空干燥，残渣加20 ml水溶解，再加乙醚20 ml在磁力搅拌器上进行振摇提取，反复提取3次，将乙醚提取液混合后蒸干。残渣干燥后加1 ml乙酸乙酯，该溶解液作为供试品溶液。取细辛对照品精确称取1 g，加甲醇30 ml，提取方式同细辛样品，制成对照品供试液。

薄层色谱法检测方式参照《中国药典》四部通则0502，分别吸取供试品和对照品供试溶液各5 μl和4 μl，以硅胶G作固定相，用普通毛细管将样品在同一硅胶G薄层板上进行点样，展开剂为正已烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（16∶3∶4）[6]，将点样后的玻板放入展开缸内展开，取出薄层板后晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，于105℃下活化30 min至斑点显色清晰。用薄层扫描仪对斑点进行扫描，结果显示，供试样品与对照品在色谱相应的位置上，斑点颜色相同（图1）。

2.1.2桂枝的薄层色谱鉴别 取本品60片，除去包衣，研细，加乙醚60 ml，40 KHz条件下超声1 h。用快速定性滤纸过滤，滤液真空干燥，残渣加1 ml乙醇溶解，该溶解液作为供试品溶液。另准确称取桂枝对照品0.5 g，加乙醇30 ml，采用水浴加热回流方式处理30 min，冷却后用快速定性滤纸过滤，滤液真空干燥，残渣加20 ml水溶解，再加乙醚 在磁力搅拌器上进行振摇提取，反复提取3次，将乙醚提取液混合后蒸干，后续步骤同细辛提取方式，制成对照品供试液。

桂枝的薄层色谱法检测方式也参照《中国药典》四部通则0502，分别吸取供试品和对照品供试溶液5 μl，以硅胶G作固定相，用普通毛细管将样品在同一硅胶G薄层板上进行点样，以油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂[7]，将点样后的薄层板放入展开缸内展开，取出薄层板后晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃条件下活化30 min至斑点显色清晰。用薄层扫描仪对斑点进行扫描，结果显示，供试样品与对照品在色谱相应的位置上，斑点颜色相同（图2）。

2.1.3牛大力的薄层色谱鉴别 取本品25片，除去包衣，研细，加浓氨溶液1.5 ml、乙酸乙酯50 ml，40 KHz条件下超声1 h。用快速定性滤纸过滤，滤液真空干燥，残渣加1 ml乙酸乙酯进行溶解，该溶解液作为供试品溶液。另准确称取牛大力对照药材2.0 g，再加0.5 ml浓氨水溶液和30 ml的乙酸乙酯，参照上述细辛提取方式制成对照品供试溶液。

牛大力的薄层色谱法检测方式也参照《中国药典》四部通则0502，分别吸取供试品和对照品供试溶液6 μl，以硅胶G作固定相，用普通毛细管将样品在同一硅胶G薄层板上进行点样，环己烷-乙酸乙酯（20∶3）为展开剂[8]，将点样后的薄层板放入展开缸内展开，取出薄层板后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃条件下活化30 min至斑点显色清晰。将薄层板至于365 nm的紫外灯下进行检视，结果显示，供试样品与对照品在色谱相应的位置上，斑点颜色相同（图3）。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 本实验所采用的色谱条件设定：色谱柱采用AgilentZORBAX-SB-C18（9.4×250，5 μm）；流动相采用乙腈-水（28∶72）等度对样品进行洗脱；柱温设定为30℃；流速设定为1.0 ml/min；进样体积为10 μl；理论塔板数以川续断皂苷Ⅵ计算，数值高于3200，波长212 nm。

2.2.2对照品溶液制备 一定量的川续断皂苷Ⅵ对照品，加入甲醇溶液制备成川续断皂苷Ⅵ储备液，浓度为2458.5 μg/ml.精确量取储备液1 ml于25 ml容量瓶中，加入流动相溶液定容至刻度线，充分混合均匀后，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得对照品供试液，每l ml含98.34 μg川续断皂苷Ⅵ。

2.2.3供试品溶液的制备 取乌芪舒筋通络片样品30粒，除去包衣层。用干净的60 mm研钵研细后，精确称取2.0 g样品于具塞锥形瓶中，加入50 ml甲醇，40 KHz条件下超声15 min，冷却后称量，并用甲醇补至原重量。混均后，用0.45 μl的微孔滤膜进行过滤。精确量取25 ml滤液，真空干燥后，加25 ml超纯水进行溶解，再加水饱和的正丁醇50 ml在磁力搅拌器上进行振摇提取，再加30 ml正丁醇反复提取3次，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次（50 ml，50 ml），再用正丁醇饱和的水洗涤2次（50 ml，50 ml），取正丁醇液，干燥后加甲醇溶解并转移至25 ml容量瓶中，定容至刻度线后，混合均匀，用0.45 μm的微孔滤膜进行过滤，滤液备用。

2.2.4阴性对照样品溶液的制备 续断阴性样品的制备根据处方比例和工艺进行处理，具体步骤参照“2.2.3供试品溶液的制备”。

2.2.5專属性试验 分别精确吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪进行峰面积的测量，具体的测量条件设定参照“2.2.1”（图4）。提示供试样品与对照样品在同一位置上具有相同的吸收峰，且分离度>1.5，阴性对照无干扰。

2.2.6线性范围考察 精密量取3.2项下的贮备液2 ml，分别用乙腈-水（28∶72）混合液稀释成49.17、78.67、98.34、147.51、196.68 μg/ml的溶液，分别进样10 μl，按3.1的色谱条件进行测量设定，以进样量（ng）作为横坐标，峰面积作为纵坐标，进行回归方程的计算，得到川续断皂苷Ⅵ的回归方程：y=18 812x-120 283，r=0.9996。提示川续断皂苷Ⅵ在491.7～1966.8 ng内呈现出良好的线性关系。

2.2.7精密度试验 准确称取对照样品10 μl，每2.5 h进样一次，重复进样6次。色谱条件参照“2.2.1“所示，结果显示，续断皂苷的RSD值为1.16%，提示设备的精密程度良好。

2.2.8重复性试验 取批号为15050401的供试样品6份，每份2 g。按照“2.2.3”的实验方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”的色谱条件进行测量，结果显示，6份供试样品中川续断皂苷Ⅵ的平均含量为614.1 μg/片，川续断皂苷Ⅵ的RSD=0.86%，提示这种方法对测量样品中川续断皂苷Ⅵ的含量具有良好的重复性。

2.2.9稳定性试验 准确称取批号为15050401的同一供试品溶液，在不同时间梯度（0、2、4、6、8 h）测定川续断皂苷Ⅵ峰面积，数据结果显示川续断皂苷Ⅵ的RSD=2.26%，这也就说明该检测方式在8 h内测定有稳定的结果。

2.2.10回收率试验 准确称取批号为15050401的同一供试品1 g，共称取9份。再准确量取对照品储备液制备成浓度为2458.5 μg/ml的溶液，每3份分别加入该溶液0.5、1、1.5 ml，参照“3.3”方式制备供试品溶液，制备的溶液分别进样10 μl，计算川续断皂苷Ⅵ的回收率，结果显示，其平均回收率为101.25%（RSD=1.40%）（表1）。

2.2.11样品含量测定 准确称取3种不同批号的乌芪舒筋通络片，按“2.2.3”供试品溶液制备方法处理并测定，以外标法计算含量，结果见表2。

2.2.12含量限度的制定 根据上述3批样品的含量测定结果，川续断皂苷Ⅵ含量的平均值为2.50 mg/g，每片平均含量为0.625 mg，若允许其含量下浮的幅度≤20%，则含量限度可定为：乌芪舒筋通络片每片含川续断皂苷Ⅵ≥0.50 mg。因不同产地、不同采收时间的药材其川续断皂苷Ⅵ成分含量略有差异[9-10]。因此拟定本品每片含川续断皂苷Ⅵ≥0.45 mg。

3讨论

3.1流动相的选择

根据中国药典和文献记载，笔者曾用流动相为乙腈-水（30∶70）[6，11-13]测定续断中川续断皂苷Ⅵ，结果分离效果不理想，在主峰的后面有一小峰，故将流动相稍作改动[14]。

3.2提取方法的选择

据文献报道，笔者用加热回流法[15-16]提取30 min和超声[17-18]15 min作比较，结果用HPLC测定出来的峰面积几乎一致，超声提取方法操作简单，耗时短，是最佳的选择。

3.3细辛、桂枝及牛大力薄层色谱鉴别的方法学验证

首先进行点样量的考察，以确定供试品取样量，对照品溶液和供试品溶液的点样量；耐用性试验中考察了自制板、烟台硅胶G板及青岛硅胶G板3种不同的薄层板，以及不同温度、湿度梯度对薄层色谱的影响[19-20]，实验结果显示，不同条件下斑点的Rf值存在差异，但色谱分离良好，斑点清晰，阴性无干扰，提示耐用性好，方法可行。

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