“叶绿体色素的提取与分离”实验教学

左小龙 乔秀芹

（1 北京市顺义牛栏山第一中学 北京 101301 2 北京市顺义区教育研究和教师研修中心 北京 101300）

1 实验内容分析

在生物学教学中，教师应积极提供机会让学生亲自尝试和实践，并依据观察到的事实进行深度思考［1］，进而加深对生物学概念的理解，提升应用知识的能力。“叶绿体色素的提取和分离”是《普通高中生物课程标准》中必修1“细胞的代谢”单元中的重要实验。通过此实验可让学生认识叶绿体色素的种类和颜色，了解叶片呈现绿色这一表象背后的实质，进而为光合作用过程和应用的学习奠定基础，同时体会层析原理及层析法在物质分离中的重要作用。

由于叶绿体中色素为脂溶性，且不同色素在有机溶剂中的溶解度不同，因此人教版教材中的此实验以无水乙醇为提取液，以石油醚∶丙酮∶苯=20∶2∶1 的混合有机溶剂作为层析液，再用滤纸条作为分离介质，完成对叶绿体色素的提取和分离。此实验能让学生了解叶绿体色素的种类和颜色，但层析液中含有致癌物质苯［2］，影响师生的健康；划滤液细线时易出现细线过宽且色素含量少的情况；层析后色素带不整齐、不明显清晰［3］；学生完成此实验后，对层析液的组成和层析原理可能存在认识误区，例如认为层析液只能是教材中的固定配比、层析后色素条带的顺序是固定不变的等。

鉴于此，笔者对该实验进行了一系列改进和延伸，旨在让学生更加深刻地理解层析技术及其原理，弄清叶绿体色素的种类和功能。改进方案，遵循简单化原则，在保证实验效果理想的前提下，降低对实验仪器的要求，同时简化操作步骤，以便更广泛地开展学生实验。

2 实验教学准备

2.1 实验材料与用具

1）材料：新鲜菠菜叶。

2）试剂：提取液（无水乙醇∶石油醚=2∶3）、层析液（石油醚∶丙酮=5∶4）、蒸馏水、二氧化硅、碳酸钙。

3）用具：研钵、称量纸、剪刀、药匙、天平、玻璃漏斗、滤纸、试管、移液管、吸耳球、试管架、硅胶G 层析板（青岛海洋化工厂）、毛细吸管、烧杯、培养皿盖、离心机、1.5 mL 离心管、1 000 μL 移液器、比色皿（0.5 cm 厚）、刀片、三棱镜。

硅胶层析板的处理： 直接购买的硅胶G 层析板（青岛海洋化工厂）规格为20 cm×10 cm，使用前需先置于烘箱中，60℃下烘干1 h，然后用玻璃刀从背面进行切割，切割成2 cm（宽）×10 cm（长）规格，此项操作需一定的技巧，由教师在课前完成。

2.2 实验报告单 为了培养学生的创新能力和探究思维，本实验先不给出实验原理，也未将可能出现的现象告诉学生，而是设计成探究性问题放在讨论分析中。现象不是教师告知的，而是学生自己观察发现的；原理不是教师讲解的，而是学生自主查阅和研究获得的［4］。

课前发放实验报告单，学生熟悉实验操作过程。实验报告单设计如表1。

表1 “叶绿体色素的提取与分离”实验报告单

3 实验教学组织

3.1 色素提取 取5 g 新鲜菠菜叶，剪碎，置于研钵中。向研钵中加入少许二氧化硅和碳酸钙，再加入提取液10 mL，迅速、充分地进行研磨［5］。将研磨液迅速倒入玻璃漏斗中进行过滤，滤液收集到试管中后，加入与滤液等体积的蒸馏水，此时试管中液体出现明显的分层现象，即色素溶于石油醚在上层，无水乙醇进入水层在下层。用移液管吸取上层深绿色滤液转移至小烧杯中。由于经过了一次萃取，加上石油醚易挥发，所以改进后的色素提取方法可极大提高滤液中色素的浓度，从色素提取液的颜色上可直观反映。

3.2 色素分离 尝试用薄层层析法取代原实验中的纸层析法。薄层层析法是一种较新的分离物质的方法，具有快速、微量、灵敏度高、分离效果好等优点。笔者在实验中用硅胶G 层析板代替滤纸。硅胶G 层析板吸附能力强，能承载更为大量的色素，且质地均匀，分离的色素条带更加清晰、整齐。

分离色素的过程如下：

1）层析液的配制：薄层层析的层析液由5 份石油醚和4 份丙酮混合而成。将9 mL 层析液加至250 mL 烧杯中，盖好培养皿盖静置10 min，使气态相达到饱和。

2）画滤液细线：用毛细吸管吸取适量滤液，在硅胶板的一端距边缘1 cm 处，从左至右不间断地快速画线。由于此时滤液中的石油醚挥发较快，因此能迅速干燥，短暂间隔后，再重复3～4 次，确保硅胶板上吸附有足量的色素。

3）层析：将划好滤液细线的硅胶板有滤液细线的一侧朝下放入烧杯，盖好培养皿进行色素的分离，透过烧杯，学生可清晰观察到层析过程。

由于硅胶板比较硬，所以滤液细线不会没入层析液中；一个烧杯中可放数个硅胶板，且彼此互不干扰。层析的速度也很快，硅胶板从上至下依次能观察到胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素，还能观察到呈褐色的去镁叶绿素和橙黄色的姜黄素，色素带直且齐。

为了使学生更直观地认识叶绿体中色素在光合作用中的作用，笔者在教学中对此实验进行了拓展和延伸。

3.3 单一色素的再提取 用刀片将硅胶板上的胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素4 条色素条带（含硅胶粉末）分别刮下来，按4 人小组分类集中，再将含有4 种不同色素的硅胶粉末分别置于1.5 mL 离心管内，加入适量无水乙醇，用毛细吸管进行搅拌混匀，以2 000 r/min 的转速离心3 min，然后用1 000 μL 移液器吸取上层滤液，获得4 种单一色素的提取液（图1），分别置于0.5 cm 厚的比色皿中。

图1 单一色素的再提取

3.4 不同色素吸收光谱的测定 在实验台上让直射白光通过三棱镜，可在后方白板上看到七色光谱。将盛有4 种不同色素的的提取液分别置于三棱镜和白板之间，则可观测到不同色素对不同颜色光的吸收不同。结果显示：叶黄素和胡萝卜素主要吸收蓝紫光，叶绿素a 和叶绿素b 主要吸收红光和蓝紫光，仔细观察还会发现，在红光区叶绿素a 相比叶绿素b 有更大的吸收能力。

图2 叶绿体色素的荧光现象

3.5 荧光现象观察 将色素提取液置于试管之中，用灯光照射，可清晰观察到叶绿素在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，即荧光现象（图2）。

4 实验教学传递的重要概念

本实验对叶绿体色素的提取和分离方法进行了改进，对色素功能的探索进行了延伸，将叶绿体色素的种类和功能这2 部分知识紧密联系在一起。学生亲历了实验的全过程，并在此过程中加深了对重要概念的理解。

1）教材实验的结果让学生明白了叶绿体色素的种类和颜色。其中，提取方法的改进突显出叶绿体色素的脂溶性特点：用石油醚和无水乙醇提取，再进一步用水分层，前、后2 次操作能充分体现色素易溶于有机溶剂的特点。层析方法的改进有助于学生加深对层析原理的理解： 用薄层层析法替代纸层析，这一介质的替换，让学生对层析法这一物质分离技术有了新的认识，而替代后出现的与纸层析不同的实验结果更是引发了学生的思考，学生更易理解条带顺序与层析液的组成和配比有关，与不同色素在层析液中的溶解度不同有关。

2）拓展实验中吸收光谱的测定有助于学生对叶绿体色素功能的理解； 荧光现象的观察能引发学生深入思考，为光合作用过程的学习奠定基础：绿色叶片在自然状态下为何观察不到荧光？ 叶绿体内的色素吸收的光能去哪了？ 学生带着问题走出实验室，进一步寻找答案，这样既激发其继续学习和探究的欲望，也让实验与理论在内容和逻辑上联系得更加紧密。