指标正交试验法优选双桂祛寒颗粒挥发油提取工艺*

刘 宁，刘效栓，李喜香，李季文

1甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2甘肃省中医院药学部

骨关节炎是患病率较高的慢性关节疾病，伴有不同程度的关节疼痛，功能障碍，以及由于关节软骨的恶化及其他关节结构参与而导致的生活质量下降［1］。据估计，60岁以上的世界人口中约有十分之一的人有关节问题，大部分是骨关节炎造成的。作为最常见的肌肉骨骼疾病之一，骨关节炎是导致疼痛、残疾和降低生活质量的主要原因。近年来，随着人口老龄化加剧，骨关节炎预计将成为未来的一个主要的卫生保健问题，在60岁以上的人群中，症状性骨关节炎的患病率预计将在2030年达到30%［2］。尽管如此，西医学的管理仍然主要是对症治疗(例如，对乙酰氨基酚，非甾体类抗炎药和物理治疗)，目前还没有有效的药理学策略来防止这种疾病的恶化［2-3］。与此同时，以中医理论为指导的中成药复方及以有效成分为主的天然药物具有多环节、多层次、多靶点综合作用的特点，其在改善生活量、缓解症状、降低致残率等方面显示出重要的临床价值和独特优势。双桂祛寒方以传统汤剂形式在我院临床使用多年，由当归、肉桂、独活等10味药组成，具有温肾祛寒止痛，逐风活血通络的功效，主要用于治疗风湿性、类风湿性关节炎，强直性脊柱炎，肩周炎，颈椎病等风寒湿痹，以传统汤剂形式在我院临床使用多年。由于传统汤剂在临床应用中有诸多不便，本实验组对其剂型改革，制备为颗粒剂。因本方中当归、肉桂、桂枝等5味药材含有较多挥发油，并且有明显的药理作用，如当归挥发油具有抗血小板凝聚、神经保护和镇痛消炎等作用［4］；肉桂和桂枝中的桂皮醛有明显的镇静、镇痛作用［5］。本实验采用水蒸气蒸馏法制得挥发油，以挥发油得率和藁本内酯及桂皮醛含量为指标，应用正交试验优选其提取工艺，然后对确定的最佳工艺进行验证，为双桂祛寒颗粒的研制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(美国Waters公司2695型),717自动进样器,2487双通道紫外检测器；FA1004电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；HWS-24电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)、烧瓶、挥发油提取器、烧杯。

1.2 试药及试剂 当归、肉桂等10味药材由甘肃省中医院提供，经李喜香主任药师鉴定为正品；藁本内酯对照品(批号4431-01-0)、桂皮醛对照品(批号110710-201720)，购自中国食品药品检定研究院；乙醚(分析纯)，购自利安隆博华(天津)医药化学有限公司；甲醇(色谱纯)，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；无水硫酸钠(分析纯)购自天津市北方天医化学试剂厂。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取方法 按处方比例精密称取肉桂、当归等5味药材，共48 g，置圆底烧瓶中，加水，浸泡，用水蒸气蒸馏法提取，于挥发油提取器中收集芳香水。

2.2 挥发油得率测定 将已制得的芳香水用乙醚萃取至水层无色，合并乙醚液，无水硫酸钠脱水，室温挥散乙醚，称重，计算挥发油得率。

2.3 含量测定方法

2.3.1 色谱条件 色谱柱：symmetryshield RPC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：327 nm(藁本内酯)，290nm(桂皮醛)；柱温：常温；进样量20μL；流动相：甲醇 - 水(65:35)；流速：1.0 mL/min。

2.3.2.1 对照品溶液的制备 藁本内酯对照品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，超声至完全溶解，作为藁本内酯对照品溶液(0.8 mg/mL)；另取桂皮醛对照品适量，精密量取，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，作为桂皮醛对照品溶液(0.0 2mL/mL)；最后精密吸取桂皮醛对照品溶液0.5 mL和藁本内酯对照品溶液1 mL置10 mL量瓶，用甲醇定容，作为藁本内酯、桂皮醛混合对照品溶液(藁本内酯含量为0.08 mg/mL，桂皮醛含量为0.001 mL/mL)。

2.3.2.2 供试品溶液的制备 吸取已制得的挥发油样品置于10mL容量瓶中，精密称定，用甲醇溶解并定容，超声(25KHz)处理30分钟混匀后，放至室温，微孔滤膜(0.22)滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.3.2.3 阴性对照品溶液的制备 精密称取不含藁本内酯及桂皮醛的药材样品，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 专属性试验 精密吸取藁本内酯、桂皮醛混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，按上述色谱条件，双波长同时测定，1=290 nm，2=327 nm；同时得到两个不同波长的色谱图。结果表明阴性对照无干扰，见图1。

A1 藁本内酯、桂皮醛混合对照品溶液（1表示290 nm)

A2 藁本内酯、桂皮醛混合对照品溶液（2表示327 nm)

图1 桂皮醛和藁本内酯的HPLC

2.3.3.2 线性关系考察 分别精密吸取藁本内酯、桂皮醛混合对照品溶液 5、10、20、30、40 uL，依次注入高效液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定，以进样量(X)为横坐标，色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：藁本内酯回归方程为：Y=2E+06X+123 102；R=0.999 1；桂皮醛回归方程为：Y=8E+08X-96776；R=0.999 9；藁本内酯和桂皮醛含量在分别在0.4～3.2 μg和0.005～0.04 μL范围内线性关系良好。

2.3.3.3 精密度试验 分别精密吸取“2.3.2.1”项下藁本内酯、桂皮醛对照品溶液，连续进样6次，桂皮醛和藁本内酯等色谱峰峰面积的RSD值分别为1.15%和1.03%，均小于1.5%，表明精密度良好。

2.3.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h进行 HPLC 色谱分析。桂皮醛等色谱峰峰面积的RSD值分别为1.37%和1.32%，均小于1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3.5 重复性试验 平行称取同一条件下得到的挥发油，按“2.3.2.2”项下方法制备供试液，以“2.3.1”项下色谱条件进样，重复进样6次，桂皮醛等色谱峰峰面积的RSD分别为1.42%和1.39%均小于1.5%，表明重复性良好。

现代社会开展“非遗”的生态化保护离不开科技创新。“非遗”的生态化传承保护要坚持与时俱进，与社会科技发展同步，要积极运用前沿的科学技术，维护“非遗”传承保护的条件，解决传承保护的短板，助推项目传承人文化层级的提升。

2.3.3.6 加样回收率测定 精密称取已知桂皮醛(4.24 mL/g)和藁本内酯(143.76 mg/g)的挥发油约0.1 g,平行取6份，分别加入桂皮醛0.424 mL和藁本内酯14.37 mg,按照供试品溶液制备方法处理，进样，计算加样回收率，桂皮醛的平均回收率为99.15%，RSD值为1.57%；藁本内酯的平均回收率为99.13%，RSD值1.62%。

2.3.3.7 样品含量测定 分别精密吸取9个供试品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定样品中藁本内酯和桂皮醛的含量。

2.4 正交试验设计

2.4.1 单因素试验 以浸泡时间、加水量、提取时间3个因素作为单因素考察对象，分别选取5个水平，按照以上提取方法提取挥发油，考察上述因素对挥发油提取率的影响。

2.4.1.1 浸泡时间的考察 按处方比例称取肉桂、桂枝、当归等5味药材，加12倍量水，分别浸泡 0、0.25、0.5、1、1.5 小时，水蒸气蒸馏法提取挥发油提取液，按“2.2”项下方法计算挥发油得率；挥发油得率分别为 0.211、0.323、0.405、0.398、0.245，故选择0.25、0.5、1小时做为浸泡时间的考察因素。

2.4.1.2 加水量的考察 按处方比例称取肉桂、桂枝、当归等 5 味药材，分别加 6、8、10、12、14倍量水，浸泡0.5小时，水蒸气蒸馏法提取挥发油。按“2.2”项下方法计算挥发油得率；挥发油得率分别为 0.314、0.423、0.462、0.387、0.410，由于14倍水相较于12倍水挥发油得率并没有显著提高，故选择8、10、12倍做为加水量的考察因素。

2.4.1.3 提取时间的考察 按处方比例称取肉桂、桂枝、当归等5味药材，加12倍量水，分别蒸馏提取 2、4、6、8、10 小时，收集挥发油提取液，按“2.2”项下方法计算挥发油得率；挥发油得率分别为 0.285、0.399、0.411、0.409、0.396。故选择 4、6、8小时做为提取时间的考察因素。

2.4.2 正交试验结果 根据单因素试验结果，选择浸泡时间(A)、加水量(B)、提取时间(C)、空白(D)为考察因素，选用L9(34)正交表，并根据每个因素的单因素考察结果选择3个最佳单因素水平(见表1)设计正交试验，按处方比例平行称取9份当归、肉桂、桂枝、独活、细辛药材，进行正交实验设计，分别测定挥发油得率并对相关指标成分含量测定结果进行综合考察。(综合评分挥发油得率、藁本内酯含量、桂皮醛含量的权重系数分别为20、40、40；综合评分=挥发油得率/最大挥发油得率×0.2×100+桂皮醛含量/最大桂皮醛含量×0.4×100+藁本内酯含量/最大藁本内酯含量×0.4×100)，因素水平表见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验表

表3 方差分析

从方差分析结果可以看出在所选水平因素范围内，各因素对挥发油含量的影响为B＞C＞A，即加水量＞提取时间＞浸泡时间，所以加水量对挥发油提取工艺有显著影响，其次是提取时间，浸泡时间几乎无影响。但为了让其有效成分能充分提取并结合实际生产情况，遂提取时间选中间值6小时，最终的结果为A1B3C2，即加12倍水(考虑到吸水量多加2倍水)，浸泡15分钟，提取6小时(C为次要因素结合实际条件选择6小时)。

2.5 验证试验 按处方比例扩大8倍称取肉桂、桂枝、当归等5味药材(平行3份)，共384 g,加入12倍量的水，浸泡0.25小时，水蒸汽蒸馏提取6小时。收集挥发油，用乙醚萃取2次，合并乙醚萃取液，用无水硫酸钠脱水，过滤，挥发至无乙醚味，计算挥发油得率，测定藁本内酯、桂皮醛含量，计算RSD值。见表4。

表4 验证试验结果

3 讨论

双桂祛寒颗粒是根据古方传统用法(汤剂)基础上改制而成的，结合处方中各味药的组成及与骨性关节炎药理作用相关的有效成分的物理特性和作用特点还有实际情况，将提取工艺分为挥发油提取和水溶性物质提取［6］，使各味药中的有效成分能够最大限度的提取，从而提高中药利用率和临床应用疗效。

该实验参考文献方法［7-8］，采用多指标综合加权评价正交试验法，使挥发油提取得率和有效成分结合，综合考察各因素及水平对双桂祛寒颗粒提取工艺的影响，在挥发油提取工艺优选中，当归、独活中所含的藁本内酯及肉桂、桂枝中所含的桂皮醛为主要的挥发油成分［9-11］。因此，选择其作为该工艺的评价指标，对藁本内酯和桂皮醛进行HPLC含量测定，色谱条件为等度洗脱，使用全波长扫描测定，由于其两种成分吸收强度差异较大，最终确定双波长测定各成分，通过多次预实验后采用HPLC法对其成分的含量测定，最终所得两者的峰形及分离度较好，阴性无干扰，方法可行。且验证试验结果表明优选的最佳提取工艺参数合理稳定，且重现性良好，可用于实际生产。