KRAS突变阳性的结直肠癌患者体细胞突变分析

董周寰，石怀银，吕亚莉，钟 梅，朱凤伟

解放军总医院 病理科，北京 100853

KRAS是人类肿瘤细胞中最早发现突变的基因之一[1]，属于RAS基因家族(KRAS、NRAS、HRAS)的一员，编码鸟苷酸结合调节蛋白(guanosine-5'-triphosphate，GTP)结合蛋白[2]。KRAS是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路下游的一个重要的调控基因，突变型KRAS可跳过EGFR接收信号，持续激活下游通路，从而导致肿瘤的发生[1]。因此，KRAS基因突变是anti-EGFR单抗药物的不敏感预测因子。美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国国家综合癌症网络(NCCN)指南都建议在使用EGFR单抗药物之前检测肿瘤KRAS基因的突变状态。文献报道，KRAS基因突变在结直肠癌中发生率为20% ～ 50%[2-4]。其中85% ～ 90%的突变都发生于外显子2的12和13号密码子 (KRAS exon 2 G12/13)[2]。KRAS基因突变使得结直肠癌患者不能从anti-EGFR药物受益。目前研究表明，有多条肿瘤相关信号通路及其基因分别或同时调控肿瘤的发生发展[2,5]，但与其他不同信号通路的肿瘤相关基因不相互排斥[6]。KRAS基因突变患者的其他肿瘤相关基因的突变特征(突变频率、突变热点分布、与临床病理相关性等)还未见报道。本实验分析KRAS突变阳性的结直肠癌中国人群中肿瘤相关基因的体细胞突变频率，探讨KRAS基因与其他肿瘤相关基因的共突变现象和相关性，为KRAS基因耐药机制研究提供数据积累，也为个体化治疗和预后判断提供帮助。

材料和方法

1 样本采集 收集2015年1月- 2016年9月本院初诊的结直肠癌患者手术标本163例。按照常规方法甲醛固定，做成石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded)样本，用石蜡切片机切成3µm的薄片并黏附在载玻片上，然后对其进行苏木精-伊红(HE)染色。染色后的病理切片由病理医师复阅诊断，挑选出肿瘤细胞≥20%的样本。

2 FFPE样本的DNA抽提 FFPE样本进行10 µm常规切片，每个样本制作10张白片。用无菌刀片将肿瘤组织刮取到洁净的1.5 ml离心管中，按照QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒(Qiagen，德国)进行基因组DNA抽提。主要步骤：二甲苯溶液脱蜡处理，裂解液加蛋白酶K裂解样本，高温逆转分子交联，吸附柱核酸吸附，洗涤，最后用40µl TE溶液将DNA从膜上洗脱下来。用Qubit 3.0荧光定量仪(Thermo scientific，美国)检测抽提的基因组DNA的浓度，琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA的片段大小。浓度在2ng/µl以上，片段大小在500 bp以上即为DNA合格。

3 PCR扩增及一代测序 针对KRAS基因最常见的突变G12/13所在的2号外显子，设计上游引物：5'-ATTACGATACACGTCTGCAGTCAACTG-3'，下游引物：5'-CAATTTAAACCCACCTATAATGGT-3'。质检合格的DNA样本首先进行PCR反应，反应体系 ：2.5µl PCR buffer，Mix 引物 2µl，dNTP 2µl，10 ng DNA，Taq酶0.5µl，去离子水补足至25µl。反应条件：预变性95℃ 7 min；变性95℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，循环35次；最后终延伸72℃ 7 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，条带清晰片段大小合理，则可进行PCR产物纯化和测序。测序反应体系20 µl：纯化的PCR 产物 1 µl，2.5×BigDye 8µl，引物 1µl，去离子水10µl。反应条件：96℃ 1 min；变性96℃10 s，退火50℃ 5 s，延伸60℃ 4 min，循环25次。测序产物纯化后，在ABI 3730xl基因测序仪(Thermo scientific，美国)上进行双向测序及分析。对这些样本进行一代测序检测后，挑选出其中50例KRAS G12/13突变阳性的样本再进行后续检测。

4 二代测序及分析 经检测KRAS G12/13突变阳性的DNA样本进行多基因检测。所检测的基因panel包括肿瘤靶向药物相关，常见抑癌基因，以及其他常见肿瘤相关突变共59个基因6 000多个热点突变。相关基因：ABL1，AKT1，ALK，APC，ATM，BRAF，CBL，CDH1，CDK4，CDKN2A，CHEK2，CSF1R，CTNNB1，DNMT3A，EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4，EZH2，FBXW7，FGFR1，FGFR2，FLT3，GNA11，GANS，HNF1A，HRAS，IDH2，JAK1，JAK2，JAK3，KDR，KIT，KRAS，MET，MLH1，MPL，NFE2L2，NOTCH1，NPM1，NRAS，PAX5，PDGFRA，PIK3CA，PPP2R1A，PTCH1，PTEN，RAF1，RB1，RET，SF3B1，SMAD4，SMARCB1，SMO，STAT3，STK11，TP53，U2AF1，VHL。 其中 APC、TP53、KRAS、PIK3CA、BRAF五 个 基因在COSMIC数据库中记录的突变频率超过10%。二代测序(next generation sequence，NGS)实验操作参考OncoAimTM肿瘤多基因突变与药物代谢检测试剂盒(Singlera Genomics Inc. Shanghai，China)说明书，主要步骤：取20 ng DNA结合试剂盒中的特异扩增子进行多重PCR扩增，经过去除扩增引物、末端修复、添加接头、连接产物纯化、文库扩增和纯化后，Qubit 3.0定量仪检测样本文库浓度为 2 ～ 15 ng/µl，空白对照文库浓度低于 1 ng/µl，LabChip QC检测文库主条带在225 bp，则文库构建完成。采用Illumina MiSeq平台对纯化后的文库进行高通量测序，测序模式设置为双端测序，2×150 bp。测序完成后，采用bcl2fastq命令将原始的bcl文件转变为标准的fastq格式文件。采用Fastqc对测序结果进行质控，去除接头序列和低质量序列，比对参考基因组，并对序列文件进行排序。通过GATK对变异位点质量进行校正，获取SNP和InDel信息，并对其进行左对齐处理，最终生成VCF文件以存储变异位点信息，最后根据通用数据库对检测得到的变异位点进行功能注释并生成报告。

5 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，样本率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 样本选择及临床病理特征 根据一代测序结果共入组50例KRAS exon2 G12/13突变阳性的结直肠癌样本，其中G12突变42例，G13突变8例。除3例样本的肿瘤细胞含量为20%以外，其余47例样本的肿瘤含量均为30%以上。其他临床信息见表1。

2 NGS数据质量 50例样本有效测序深度最低790×，最高1 307×；数据覆盖度均一性均＞90%(92.9% ～ 98.5%)。根据突变频率≥5%，覆盖度≥30，变异等位基因数≥10进行变异位点筛选。所有样本均检测到KRAS突变，且KRAS exon2的突变与一代测序结果完全一致，表明本研究的NGS测序数据真实可靠。本研究的50例样本中，有48例样本检测到了KRAS以外的基因突变，包括核苷酸碱基替换和插入缺失突变，有两个样本未检测到KRAS以外的基因突变。单个样本的基因突变数目不多，仅1例样本有5个KRAS以外的突变位点，其余样本检测到1 ～ 3个突变位点(图1A)。

3 样本基因突变比率 检测的59个基因中，有13个基因检测到至少1次突变(表2，图1B)。除KRAS基因外，本研究中突变样本数超过10%(5例 以 上 )的 基 因 有 TP53(31例，62%)、APC(23例，46%)、PIK3CA(11例，22%)和 SMAD4(7例，14%)。有2个样本检测到TP53发生了2个突变；有2个样本检测到APC发生了2个突变。其余12个基因在1个样本中仅检测到1个突变。另外，同 为 RAS家 族 的 HRAS、NRAS、HRAS， 以 及COSMIC数据库中突变频率超过10%的BRAF基因，均未检测到突变。

4 基因突变位点统计 除KRAS基因外，发生突变的12个基因一共检测到65种不同突变，绝大多数突变在这50例样本中仅出现1 ～ 2次。APC R1450*、APC T1556fs*3、SMAD4 R361C/H各出现了5次；TP53 G245S、PIK3CA H1047R各出现了4次； TP53 R175H出现了3次。50例样本一共检测到11个PIK3CA突变，其中5个(45.5%)发生在exon 20(4个H1047R，1个Y1021C)，3个(27.3%)发生在exon 9(2个E545K，1个Q546K)，3个(27.3%)发生在其他外显子区域(C420R，N345K，K111E)。没有检测到同时发生两个PIK3CA突变的样本。

5 基因突变与临床的相关性 本研究所检测到的基因突变数与入组患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移情况以及肿瘤分化程度均无相关性。除KRAS基因外，突变频率高于10%的4个基因TP53、APC、PIK3CA和SMAD4与入组患者临床信息的相关性见表1。以上4个基因在不同肿瘤发生位置的突变分布存在差异(图2A)。结肠癌(包括左半结肠、右半结肠、横结肠、直乙交界)患者突变频率最高的基因是TP53(27/36，75%)，其次为APC基因(15/36，41.7%)，左右半结肠以及横结肠之间的基因突变分布一致；而在直肠癌患者中，突变频率最高的是APC基因(8/14，57.1%)，TP53基因在直肠癌患者中的突变频率(4/14，28.6%)显著低于结肠癌患者(P=0.002，表1，图2B)。

图1 KRAS突变阳性的结直肠癌患者肿瘤相关基因突变分布 A：样本的基因突变数量分布； B:肿瘤相关基因突变次数分布Fig. 1 Mutation distribution of tumor-related genes in patients with KRAS mutation and positive colorectal cancer A: Quantitative distribution of gene mutations; B: The number of mutations of tumor-related genes detected

图2 肿瘤相关基因在结直肠癌不同发生部位的分布 A： TP53、APC、PIK3CA和SMAD4在不同肿瘤发生位置的突变频率； B：TP53在结肠癌和直肠癌的突变频率Fig. 2 Distribution of tumor-related genes in different sites of colorectal cancer A: Mutation frequencies of TP53,APC, PIK3CA and SMAD4 gene in different tumor locations; B: Mutation frequency of TP53 in colon and rectal cancer

表1 结直肠癌肿瘤组织中高频突变基因与临床特征的关系Tab. 1 Relationship between high frequency mutation gene and clinical features in colorectal cancer tissue

表2 基因突变数量分布Tab. 2 Gene mutation quantity distribution

讨 论

本研究所用的样本均为保存1 ～ 2年的FFPE样本。这类样本在制作和存储过程中，DNA容易发生降解和损伤，导致测序质量下降甚至测序失败。本项目50例FFPE样本均能成功建库并上机测序，所得的下机数据覆盖度高，均一性好，质量可靠。其中对KRAS基因的测序结果与一代测序检测的结果一致，表明本研究所用的检测方法准确性高，结果真实可信。

超过一半的结直肠癌患者有RAS家族(KRAS、NRAS、HRAS)或者BRAF突变，且这些突变互相排斥[7]。本研究全部50例KRAS exon2 G12/13突变阳性患者，同样未检测到NRAS、HRAS、BRAF的突变。本研究也未检测到肿瘤中常见的EGFR突变，支持KRAS与EGFR一般不存在共突变的结论[5]。

TP53是重要的抑癌基因，TP53突变是人类肿瘤发病的主要因素之一。本研究中TP53基因是除KRAS基因外突变次数最多的基因，突变频率(62%)与其他研究结果较为接近(30% ～ 70%)[2]，支持TP53突变与KRAS突变受不同的信号通路影响[8]。检测到的TP53发生在外显子4 ～ 8，其中突变次数最多的两个热点G245S、R175H均在该基因突变较为集中的结构热点区域内[9]，将影响细胞生长、凋亡的调控，以及DNA修复功能。此外，本研究中TP53在结肠癌中的突变频率(75%)显著高于直肠癌(28.6%)，即结肠癌比直肠癌存在更多的KRAS、TP53的共突变现象。

腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因是结直肠癌相关研究中广泛报道的高频率突变基因[10]，检测到其突变频率为46%，与其他中国人群结直肠癌中的研究结果(突变频率为30%左右[11-12])相近，略低于国外的一些报道(50% ～ 80%[12-13])。结直肠癌中APC基因的两个体细胞突变热点密码子1309和1450，均在本研究的样本中被检测到。其中R1450*被检测到5次(10%)，是本研究中发生突变次数最多的位点之一；而E1309fs*4仅被检测到1次。另一个突变位点T1556fs*3也发生了5次突变(10%)，而这个位点在别的研究中报道较少[14]，说明这个位点可能与KRAS存在一定的相关性。

我们检测到11例样本(22%)发生了PIK3CA突变，与文献报道[15]一致。突变主要存在于exon 20和exon 9。本次检测到的PIK3CA突变频率与以往的报道相近 (14.5%[6]，10% ～ 18%[7]，32%[16])，但不支持之前报道的PIK3CA与KRAS的正相关关系[6-7]。可能的原因是与KRAS G2/13突变存在正相关关系的是PIK3CA exon 9的突变，而本研究样本量较少，exon 9突变仅3例样本，还不能看出差异。在exon 9和exon 20检测到3个突变位点都是报道过的突变热点(hotspots)[17]，尤其是位于exon 20的H1047R位点在4例样本(8%)中被检测到。

SMAD4是重要的肿瘤抑制基因。SMAD4在48%的胰腺癌中都有突变，在包括其他肿瘤中突变频率均＜10%[18-19]。而在结直肠癌中仅约6%检测到突变[19]。本研究检测到7例样本(14%)发生了SMAD4突变，且其中5例(10%)发生在密码子361。R361是SMAD4突变热点之一，位于识别蛋白形成R-SMADS复合体的蛋白环区域[20-21]。R361C/H是本研究中发生突变次数最多的位点之一，提示SMAD4及其R361突变与KRAS存在一定的相关性，我们还需要入组更多SMAD4突变阳性的样本加以证实。

综上所述，在KRAS突变阳性的结直肠癌组织样本中，检测到较多突变的这些基因的突变频率或者突变热点分布，与以往报道的整体的结直肠癌组织样本中的分布存在差异。表明这些基因或热点的突变与KRAS及其通路存在一定的相关性。在对KRAS突变阳性的结直肠癌进行选择药物干预方案时，需要综合考虑其他基因的突变情况，有利于为患者提供更有效的治疗。