脐带间充质干细胞对2型糖尿病大鼠的治疗作用及机制研究

龚正媛，张瀶曦，尹雅琪，邹俊彦，于松岩，李 冰，薛 婧，程 愈，母义明

解放军总医院 内分泌科，北京 100853

糖尿病是心血管疾病、慢性肾疾病、失明和截肢的主要原因之一[1]。传统降糖药物在一定程度上能够控制血糖、延缓并发症的出现，但无法从根本上遏制糖尿病的病理生理进程和糖尿病并发症的发生[2]。因此，研发能从根本上改善糖尿病、遏制糖尿病并发症发生发展的新方法是当前糖尿病治疗研究的重点。间充质干细胞是一类具有低免疫源性、自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，其主要来源有脂肪、骨髓、脐带等组织，自发现以来广泛应用于再生医学的研究[3-4]。已有大量研究报道，间充质干细胞的输注能降低血糖，改善胰岛素抵抗，降低糖尿病并发症发生的风险[5-7]，但其具体机制仍不十分清楚。为进一步探索间充质干细胞改善糖尿病并发症的机制，本文运用CM-Dil染料对UC-MSCs进行染色定位示踪，了解间充质干细胞输注到糖尿病大鼠体内后在各个脏器中的归巢情况。

材料和方法

1 材料 30只8周龄雄性SD大鼠(SPF级)，体质量200 ～ 220 g，购自解放军总医院医学实验动物中心，动物合格证号：11400700238064；链脲佐菌素(STZ)和DAPI核染料购自Sigma公司；CMDil购自Invitrogen公司；血糖仪购自强生公司；包埋剂(OCT)购自SAKURA公司；高脂饲料(high fat diet，HFD，D12492)购自Research Diets公司；山羊封闭血清、抗体稀释液、磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自百奥生物公司；无血清培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco公司。

2 2型糖尿病模型建立和分组 30只8周龄雄性SD大鼠随机抽取10只给予普通动物饲料饲养，其余大鼠则给予高脂饲料，每2周称重1次。8周后高脂饲养的大鼠禁食不禁水12 h后称重。将STZ按照25 mg/kg的剂量进行腹膜内注射，隔日检测尾静脉随机血糖。连续3 d随机血糖≥16.7 mmol/L视为2型糖尿病造模成功[8]。造模过程中无大鼠死亡，继续高脂喂养8周。将造模成功的大鼠随机分为糖尿病组(DM组，n=10)和UC-MSCs治疗组(MSC组，n=10)，普通饲料饲养大鼠设为正常对照组(N组，n=10)。以上所有操作均符合实验动物保护法。

3 MSCs的分离、培养和表型鉴定 无菌条件下采集于解放军总医院行剖宫产足月胎儿的脐带，并签署知情同意书。脐带用PBS充分洗涤，去除残留血液、脐带外膜组织和血管组织，得到脐带Wharton胶组织并剪碎，于37℃温度下用0.1%Ⅳ型胶原酶消化18 h后经100目筛网过滤，滤液经1 000 r/min离心，获得细胞沉淀用10ml培养基重悬接种于75 cm2的培养瓶中，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，当细胞生长至接近85%融合时，消化细胞并以1∶3比例接种到新的培养瓶中进行传代培养，传至第4代时备用。取生长至85%融合的第4代细胞，消化洗涤后分别加入流式抗体 CD45-FITC、CD90-FITC和 CD105-PE， 相 应的人IgG作同型对照，使用流式细胞仪检测UCMSCs免疫表型。取生长至85%融合的第4代细胞接种于6孔板，利用向脂肪细胞及骨细胞定向分化的培养基诱导UC-MSCs定向分化，并分别采用油红O和茜素红染色进行鉴定[8-9]。

4 UC-MSCs输注治疗 第4代UC-MSCs融合至70% ～ 80%，经0.25%胰酶进行消化，每3×106UC-MSCs细胞重悬于0.5 ml PBS中，通过尾静脉输注到MSC组大鼠体内，DM组和N组则尾静脉输注等量PBS，每2周输注1次，共输注4次。

5 检测指标 每次治疗后1周测体质量、血糖(所有随机血糖监测均于下午15：00 - 16：00进行)，治疗前、中、后各测定1次尿蛋白，处死前进行IPGTT实验。肾小球硬化表现为毛细血管腔塌陷和(或)玻璃样变，肾小球硬化程度评分采用Raij等[10]的半定量法计算肾小球硬化指数。

6 UC-MSCs的CM-Dil染色及Dil-MSCs输注CM-Dil粉末离心后加入40µl DMSO试剂溶解备用。第4代UC-MSCs融合至70% ～ 80%进行消化，每1×106UC-MSCs细胞用1 ml PBS重悬，并加入1µl配好的CM-Dil进行标记，于37℃避光孵育5 min，4℃孵育15 min后以1 000 r/min速度离心5 min，去上清液，洗涤过程重复2次，细胞沉淀以每3×106用0.5 ml PBS重悬，在第4次干细胞治疗后2周，每组随机抽取3只大鼠进行Dil-MSCs输注，输注细胞量均为3×106/只。

7 HE染色及示踪 Dil-MSCs移植后72 h处死所有大鼠，取胰腺、肾、肝和脾。Dil-MSCs移植大鼠所取组织制作连续冷冻切片后观察各组织UCMSCs细胞数，非Dil-MSCs移植鼠组织制作石蜡切片，行HE染色。

8 统计学分析 所有数据均采用SPSS19.0软件进行分析。计量数据以-x±s表示，组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 UC-MSCs输注治疗后大鼠体质量、血糖、糖耐量变化 UC-MSCs第1次输注后1周MSC组大鼠随机血糖无明显变化，治疗2次后血糖逐渐降低，治疗4次后MSC组血糖水平为(23.9±3.7) mmol/L(n=10)，N 组血糖水平为 (8.3±1.4) mmol/L(n=10)，DM组血糖维持在(28.2±2.9) mmol/L(n=10)(图1A)。N组大鼠平均体质量约为695 g，DM组大鼠平均体质量约为582 g，MSC组大鼠平均体质量约为599 g，MSC组与DM组相较于N组均表现为消瘦(P＜0.01)，但与DM组相比UC-MSCs多次输注对糖尿病大鼠的消瘦状态有所改善(P＜0.01，图1B)。IPGTT实验结果显示，腹腔注射葡萄糖前，DM组空腹血糖为15.4±1.2 mmol/L，MSC组空腹血糖为13.8±0.8 mmol/L(P＜0.01)。葡萄糖注射30 min时，两组血糖分别为32.5±4.0 mmol/L和28.2±2.3 mol/L(P＜0.01)；60 min时，两组血糖分别为33.2±3.0 mmol/L和28.6±2.3 mmol/L(P＜0.01)；90 min时，两组血糖分别为31.5±2.8 mmol/L和28.4±1.6 mmol/L(P＜0.01)；120 min时，两组血糖分别为31±2.3 mmol/L和25.7±1.1 mmol/L(P＜0.01)，IPGTT实验结果显示任何时间点MSC组血糖均明显低于T2DM组(P＜0.01，图1C)。

2 各组肾病理改变及干细胞归巢情况 HE染色观察肾组织结构发现，与正常对照组相比，DM组出现明显的肾小球硬化，而多次UC-MSCs治疗降低了糖尿病大鼠的肾小球硬化程度(图2A，图2C)。CM-Dil标记干细胞示踪结果显示，在输注干细胞72 h后，只有少量UC-MSCs到达肾，其中DM组到达肾的UC-MSCs较N组和MSC组多(P＜0.05)。

3 各组肝病理改变及干细胞归巢情况 HE染色观察肝组织发现，与正常对照组相比，DM组出现明显的脂肪肝，细胞内可看到明显的脂滴聚集；MSC组的肝细胞形态虽然较N组肥大，但细胞内未出现明显的脂滴聚集(图3A)。CM-Dil标记干细胞示踪结果显示，在输注干细胞72 h后，只有少量UC-MSCs到达肝，其中DM组到达肝的UC-MSCs较N组和MSC组多(P＜0.05，图3B，图3C)。

4 各组胰腺病理改变及干细胞归巢情况 HE染色观察胰腺组织结果发现，与N组相比DM组出现明显的胰岛皱缩，4次UC-MSCs治疗使MSC组该现象明显改善(图4A)。CM-Dil-MSC输注后72 h并未观察到干细胞归巢至胰腺组织(图4B)。

5 各组脾干细胞归巢情况 脾脏中发现大量UCMSCs的归巢，主要分布于红髓和边缘区，且各组归巢干细胞数目无统计学差异(图5A，图5B)。

讨 论

图1 多次UC-MSCs输注对糖尿病大鼠随机血糖、体质量及糖耐量的影响(MSC组vs DM组，aP＜0.05, bP＜0.01)Fig. 1 Effect of UC-MSCs on blood glucose level (A) and body weight (B) as well as glucose tolerance (C) in diabetic rats (MSC group vs DM group, aP＜0.05, bP＜0.01)

图2 大鼠肾HE染色及示踪结果(aP＜0.05, vs N组,bP＜0.01, vs DM组。图A，比例尺=20μm；图B，比例尺=100μm)Fig. 2 Results of HE staining and UCMSCs homing in kidney (aP＜0.05, vs N group，bP＜0.05, vs DM group. Scale bar in panel A:20μm; B: 100μm)

图3 大鼠肝HE染色及示踪结果 (aP＜0.05, vs N组, bP＜0.05, vs DM组。图A，比例尺=20μm；图B，比例尺=100μm)Fig. 3 Results of HE staining and UC-MSCs homing in liver (aP＜0.05, vs N group, bP＜0.05, vs DM group. Scale Bar in panel A: 20μm; B:100μm)

图4 大鼠胰腺HE染色及示踪结果(图A，比例尺=20μm；图B，比例尺=100μm)Fig. 4 Results of HE staining and UC-MSCs homing in pancreas (scale Bar in panel A: 20μm; B: 100μm)

图5 大鼠脾干细胞示踪结果(NS表示各组差异无统计学意义， A图比例尺=100μm)Fig. 5 Results of UC-MSCs homing in the spleen (NS=no significant difference, scale bar in panel A :100μm)

截至2017年全球约有4.25亿人患有糖尿病[11]。持续性高血糖与长期代谢异常可导致全身组织器官功能障碍甚至衰竭，常见糖尿病并发症包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病足、糖尿病心肌病、糖尿病骨病等[12]。现有的治疗方案可以控制血糖或暂时改善靶组织中的胰岛素敏感性，但无法逆转胰岛素抵抗和进行性的B细胞功能障碍[8]。间充质干细胞是一类能够分化成间充质谱系的多能细胞，可以从多种组织中分离出来，并且易于在体外进行扩增培养[13]。Zhu等[14]发现在对雄性新西兰兔进行局灶性脑缺血造模后立即注射人脐带血间充质干细胞能显著抑制炎性细胞的浸润，增加缺血区域周围的神经元密度，降低缺血区域周围细胞凋亡的百分比。而Cheng等[15]在临床研究中证明了UC-MSCs移植可有效改善脊髓损伤后神经功能的恢复，其疗效远优于康复治疗和自愈。在糖尿病治疗方面，Gao和Lee等[16-17]的文章中提及MSCs可以促进胰岛B细胞的再生，保护内源性胰岛B细胞免于凋亡，从而改善机体高血糖状态。Davey等[5]的综述中总结了一些干细胞治疗糖尿病并发症的相关研究，但是这些研究中的疾病模型病程较短，干预手段多为单次注射治疗，且较少涉及具体机制的探索。

本研究结果显示，多次UC-MSCs输注治疗后，相较于DM组，MSC组血糖明显降低，糖耐量水平及消瘦状态改善，肾小球硬化及脂肪肝程度有所减轻，同时胰腺的病理状态得到改善，表明多次输注UC-MSCs对2型糖尿病大鼠有一定的治疗作用。

通过对干细胞进行CM-Dil染色标记示踪发现，DM组肝和肾中的干细胞数目多于N组和MSC组(P＜0.05)。有研究报道，受损组织可以表达特定的炎症介质以促进MSCs迁移、浸润到损伤部位，这一过程中信号通路如CX3CL1-CX3CR1、CXCL12-CXCR4和CCL2-CCR2起到重要作用[18-19]。结合本研究结果，提示MSCs有一定趋化性，且该趋化性与组织损伤密切相关。但总体而言，归巢于肝、肾、胰腺的UC-MSCs数量极其有限，依靠归巢干细胞的局部效应可能难以发挥如此明显的治疗效应，由此提示UC-MSCs对2型糖尿病的治疗作用可能更多地依赖于其他方式。有研究报道MSCs能够分化成胰岛素分泌细胞，以葡萄糖依赖性的方式释放胰岛素，从而改善糖尿病症状[20-21]。但Davey等[5]认为这种可能性较小，MSCs可能更多地通过分泌免疫调节因子阻止内源性T细胞对B细胞的破坏间接发挥作用。结合以上研究我们推测，在本研究中，对于该2型糖尿病大鼠长期病程模型，多次输注的UC-MSCs可能是通过分泌效应调节免疫继而发挥治疗作用。

此外，本研究还观察到大量UC-MSCs归巢于脾，且三组脾中归巢干细胞数目差异无统计学意义，这可能与脾的储血、滤血等功能有关。最近一项关于脾在脂肪间充质干细胞治疗T2D中的作用的研究显示，脾切除会导致间充质干细胞的治疗效果显著降低，加剧高血糖和胰岛素抵抗[22]。有研究报道脾能够参与炎症反应，如Gotoh等[23-24]研究发现，脾切除术会导致下丘脑、肝和白色脂肪组织的炎症反应加重，而这些改变会被外源性IL-10所逆转。在IL-10缺乏症中，脾切除对这些多器官中的炎症反应几乎没有影响，表明脾参与炎症反应可能主要依赖于IL-10。结合本文研究结果我们推测，在UC-MSCs对T2D的治疗过程中，脾可能起到重要作用，而且IL-10很可能担任关键角色，但具体机制有待进一步探索。