褪黑素激活大鼠大脑中动脉BKCa通道的受体依赖和非受体依赖途径*

陈 渝， 徐召霞， 张慧荣， 吴 迎， 石丽君

(北京体育大学运动与体质健康教育部重点实验室， 北京 100084)

褪黑素(melatonin，MT)是松果腺分泌的主要激素，具有广泛的生物学作用，如调节生物的昼夜节律、提高免疫力、改善睡眠、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗高血压等[1-3]。褪黑素通过调节动脉血管的内径，影响动脉血压和局部器官及组织的血流量[4, 5]。大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+-activated K+channels，BKCa)在血管平滑肌细胞膜上分布广泛，与血压密切相关[6]。当其开放时，K+外流增加引起膜电位超级化，导致电压依赖性钙离子通道关闭，Ca2+内流减少，使血管舒张[7]；相反，钾通道关闭，引起膜电位去极化，[Ca2+]i升高，导致血管收缩。由于BKCa通道电流和KV通道电流是全细胞K+电流最主要的两种成分，因此，加入特异性KV通道阻断剂4-AP后，剩余电流为BKCa电流，加入特异性BKCa通道阻断剂IbTX后，剩余电流为Kv通道电流。

褪黑素受体共三种亚型MT1，MT2和MT3受体。MT1，MT2受体属于G蛋白耦联受体，有7个跨膜段，均存在于心血管系统，且在脑动脉平滑肌细胞膜和细胞质中大量表达，表现为高亲和力，具有饱和性、可逆性等特点[8]。褪黑素受体对血管压力的调节作用主要是通过MT1和MT2受体进行介导。前期有关脑动脉的研究表明，褪黑素对脑动脉的收缩起调节作用，这是由MT1和/或MT2受体激活后通过抑制BKCa通道介导的[9, 10]。尽管褪黑素对心血管的作用已被广泛报道，但褪黑素对脑动脉平滑肌细胞上BKCa通道的直接作用即非受体依赖性作用却知之甚少。褪黑素作为一种高脂溶性激素，可迅速扩散到各组织器官，因此，褪黑素调节血管张力的效应很可能是多种活性共同作用的结果。因此，我们推断褪黑素可能通过受体依赖途径和非受体依赖途径对BKCa通道产生作用。鉴此，本实验通过研究褪黑素对大脑中动脉BKCa通道电流的影响，旨在探讨褪黑素通过BKCa通道介导血管张力变化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型

8周龄SPF级雄性Wistar大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，分笼饲养，自由饮食饮水，温度控制在24°C左右，12∶12昼夜节律人工控制光照，以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养，自由进食水。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：褪黑素(melotonin)，2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole)，4-氨基吡啶(4-AP)，蝎毒素(IbTX)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，牛血清蛋白(BSA)，木瓜蛋白酶(papain)，二硫苏糖醇(DTT)，F型胶原酶(collagenase F)，蛋白酶K (K-Asp)，腺苷-5'-三磷酸二钠盐(Na2ATP3)，乙二胺四乙酸(EGTA)均购自Sigma-Aldrich公司，其他试剂均为国产分析纯。

溶液配制：分离缓冲液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.6，MgCl21，Glucose 10，HEPES 10，Na2HPO40.42，NaH2PO40.44，NaHCO34.2，NaOH调pH至7.4。酶液(mg/ml)：BSA 2.0，papain 4.0，DTT 1.0，collagenase F 0.2溶于分离缓冲液中。全细胞记录细胞外液(mmol/L)：NaCl 134，KCl 6，MgCl21，CaCl21.8，glucose 10，HEPES 10，用KOH调pH至7.4。全细胞记录电极内液(mmol/L)：K-Asp 110，KCl 30，EGTA 1，Na2ATP3，CaCl20.85，glucose 10，HEPES 10，KOH调pH至7.2。单通道记录浴液(mmol/L)：KCl 45，K-Asp 100，EGTA 1，HEPES 10，glucose 5，KOH调PH值至7.4。单通道记录电极内液(mmol/L)：KCl 100，K-Asp 45，EGTA 1，HEPES 10，glucose 5，KOH调PH值至7.4。

主要仪器：垂直拉制仪(PC-10，Narashige，Japan)，数据采集系统(Axon Instruments，Digidata 1440，USA)，膜片钳放大器(Axon Instruments，MultiClamp 700B，USA)，数据采集分析软件(Axon Instruments，pClamp10.4，USA)

1.3 实验设计

实验以急性分离的大鼠脑中动脉平滑肌细胞作为研究对象，使用全细胞膜片钳技术记录K+电流，加入特异性KV通道阻断剂4-AP (3 mmol/L)后记录的电流为BKCa通道电流，加入特异性BKCa通道阻断剂IbTX (100 nmol/L)后记录的电流为KV通道电流。待电流幅值不再发生变化时加入褪黑素(100 μmol/L)观察BKCa通道和KV通道的电流变化，确定褪黑素对BKCa通道的作用；加入褪黑素受体阻断剂luzindole (1 μmol/L) 检测褪黑素(100 μmol/L)对BKCa通道全细胞记录模式的电流幅值和贴附式记录模式不同电压Po值的影响，观察褪黑素激活BKCa通道的受体依赖途径；采用内面向外记录模式检测不同浓度褪黑素(1 μmol/L，100 μmol/L)对BKCa平均单通道电导(G)，Po值，To值和Tc值的影响，观察褪黑素激活BKCa通道的非受体依赖途径。

1.4 电生理记录

1.4.1 急性脑中动脉平滑肌细胞分离 将全脑至于4℃分离缓冲液中。用镊子将大脑中动脉剥离，剪成约1.5 mm的小段，放入酶液中，37℃水浴消化约25 min后用分离液漂洗3次，轻柔吹打后将所得细胞置于4℃冰箱，贴壁备用。

1.4.2 全细胞钾电流记录 将贴壁细胞换以全细胞记录外液。电极采用垂直拉制仪两步拉制，电极充灌电极内液后，阻值为2～6 MΩ。采用传统电压膜片钳技术记录脑动脉平滑肌全细胞K+电流。将细胞钳制在-70 mV，从-70 mV给予连续电压刺激到+70 mV，阶跃10 mV，刺激时间400 ms。加入3 mmol/L 4-氨基吡啶(4-AP)或者100 nmol/L IbTX测定KV通道和BKCa通道的电流幅值，在此基础上，加入100 μmol/L的褪黑素，记录电流幅值。

1.4.3 单通道BKCa通道电流记录 采用贴附式和内面向外模式记录BKCa单通道电流，细胞内外液采用对称性高K+(145 mmol/L)溶液。电极充灌电极内液后阻值为10～15 MΩ。采用通道的钳制数量(N)和通道开放率(Po)的乘积NPO作为通道稳态活性的指标。 NPO标准化为通道最大开放概率。BKCa通道的数量是通过较高电压和/或浴液Ca2+浓度对应的最大电流水平进行测定的。采用pClamp10.4软件分析BKCa通道的Po值，幅值和动力学特征。NPO-voltage(V)关系采用Boltzmann方程进行拟合：

PO=1/{1+exp[-ZF/RT(V-V1/2)]}

V1/2表示半数通道激活的膜电位，F表示法拉第常数，R为气体常数，T为绝对温度。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 褪黑素增加大脑中动脉平滑肌全细胞BKCa通道电流

加入BKCa通道特异性阻断剂IbTX (100 nmol/L)或KV通道特异性阻断剂4-AP (3 mmol/L)后，再加入褪黑素(100 μmol/L)所得电流如图1所示。为避免细胞表面积不同对全细胞K+电流大小产生影响，本文采用膜电容进行标准化，即电流密度(pA/pF)。将细胞钳制在+70 mV时，4-AP作用后电流幅值降低为原来的78.41%±6.85%，IbTX作用后电流幅值降低为原来的28.14%±3.11%，表明外向K+电流主要包含4-AP敏感的KV通道电流和IbTX敏感的BKCa通道电流。

4-AP孵育后，加入100 μmol/L褪黑素后，BKCa通道电流密度峰值增加至(37.81±3.50) PA/PF。而IbTX孵育后，加入相同浓度褪黑素后KV通道电流密度峰值无显著变化，表明褪黑素激活BKCa通道，但不激活KV通道。

Fig.1Effects of melatonin on whole-cell IK

A: Whole-cell IKrecorded in the presence of 4-AP (3 mmol/L) or IbTX (100 nmol/L); B: Bar chart summarizing the inhibition of IKamplitudes after 4-AP and IbTX application (n=6); C: Current-voltage relationship showing the effect of melatonin (100 μmol/L) on the whole-cell IKdensity in the presence of 4-AP or IbTX; 4-AP: 4-aminopyridine; IbTX: Iberiotoxin; Mel: Melatonin

*P<0.05vscontrol

2.2 褪黑素通过MT1/MT2受体激活BKCa通道

为明确BKCa通道的激活是否由MT1/MT2受体介导，全细胞K+电流加入4-AP后余下BKCa通道电流，加入褪黑素受体抑制剂2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole，1 μmol/L)作用细胞后再加入褪黑素(图2)。结果发现，luzindole对BKCa通道电流幅值无显著影响，褪黑素使BKCa通道峰值电流密度从22.94±2.50 pA/pF增加至28.18±2.50 pA/pF。与未加luzindole对照组(从21.58±2.20 pA/pF增加至39.92±4.00 pA/pF)相比，褪黑素引起的电流密度峰值增加幅度显著被抑制。表明褪黑素激活BKCa通道部分是由MT1/MT2受体介导。

Fig.2Melatonin activates BKCachannel through MT1/MT2 receptor

A: Currents of melatonin on whole-cell BKCachannels with or without MT1/MT2 receptor blocker (Luz, 1 μmol/L); B and C: Current-voltage relationship showing the effects of melatonin (100 μmol/L) on the whole-cell BKCacurrent density in the presence of 4-AP; C: Current-voltage relationship showing the effect of melatonin (100 μmol/L) on the whole-cell BKCacurrent density in the presence of 4-AP together with vehicle or Luz (n=6); Luz: Luzindole

2.3 褪黑素增加大脑中动脉平滑肌细胞BKCa通道电压敏感性

褪黑素对BKCa通道活性的影响采用细胞贴附记录模式进行观察。如图3所示，细胞内外液采用对称性高K+(145 mmol/L)溶液，细胞钳制阶跃电位从0 mV到+50 mV ([Ca2+]free=1 μmol/L)。结果显示，随着膜电位增加，BKCa单通道Po值显著增加。褪黑素(100 μmol/L)显著增加Po值。Po-电压曲线采用Boltzmann方程进行拟合，计算通道开放半数所对应的电压(V1/2)。与未加药(V1/2=48.87±0.41 mV)相比，加入100 μmol/L褪黑素(V1/2= 40.27±0.66 mV)后V1/2显著下降，但加药前后斜率无显著变化。

为确定褪黑素激活BKCa通道是否通过MT1/MT2受体，加入luzindole (1 μmol/L)后，将细胞钳制在+40 mV，100 μmol/L褪黑素使通道Po增加1.71±0.21倍，显著低于未加药对照组(4.62± 0.50倍)，而单独加入luzindole对BKCa通道的活性无显著影响。表明luzindole能显著抑制褪黑素引起的BKCa通道Po增加。

Fig.3Effects of melatonin on BKCachannels in cell-attached patch-clamp configuration

A: Single-channel currents of melatonin acting on BKCachannels at different membrane voltage; B: Effects of melatonin on voltage sensitivity of BKCachannels. Curves were fitted with the Boltzmann equation; C: Melatonin acting on single BKCacurrents with and without Luzindole at the holding potential of +40 mV; D: Bar chart summarizing the melatonin-induced increase of Po (fold of control) between groups (n=6) ; Po: Open probability

*P<0.05vsmelatonin-only treated group

2.4 褪黑素增加脑动脉平滑肌细胞BKCa通道开放概率

如图4所示，采用内面向外膜片钳记录模式观察褪黑素对BKCa通道活性和门控特性的影响。在含0.1 μmol/L Ca2+对称的145 mmol/L K+溶液中加入1 μmol/L，100 μmol/L的褪黑素，线性拟合平均单通道电导(G)为285.70±25.30 pS(n=6)，表明褪黑素对通道电导无显著影响。

为进一步了解不同浓度褪黑素对BKCa通道门控特性的影响，将细胞钳制在+40 mV，褪黑素使Po值显著增加，并呈浓度依赖性。 褪黑素作用后通道平均开放时间(To)14.63±1.88 ms (1 μmol/L)，8.83±1.08 ms (100 μmol/L)，均较未加褪黑素组(25.78±3.30 ms)显著减少。平均关闭时间(Tc)为88.47±15.39 ms (1 μmol/L)，31.75±5.96 ms (100 μmol/L)，也均较未加褪黑素组(218.71± 36.50 ms)显著减少，但Tc减少幅度显著高于To减少幅度。因此，褪黑素显著增加BKCa单通道的Po值。

Fig.4Effects of melatonin on BKCachannels in inside-out patch-clamp configuration

A: Representative recordings of single-channel currents at a membrane voltage of +40 mV in the presence or absence of melatonin (0, 1 and 100 μmol/L); B: Summary of the conductance, Po, dwell time of open state and closed state (n=6)

*P<0.05vscontrol (0 μmol/L melatonin);#P<0.05vs1 μmol/L melatonin

3 讨论

本研究结果表明，褪黑素通过直接和结合MT1/MT2受体间接激活大脑中动脉平滑肌细胞BKCa通道。这是褪黑素在脑动脉循环中第一次被发现通过非受体依赖途径和受体依赖途径激活BKCa通道介导血管舒张功能。

脑血管疾病和脑循环密切相关，研究发现短暂性脑缺血发作患者颅内血管病变中大脑中动脉最多，主要为大脑中动脉狭窄。因此，本研究选取大脑中动脉作为研究对象。褪黑素对血管张力的影响目前已有大量研究报道，但其结果并不一致。如Régrigny等人[10]发现褪黑素引起麻醉大鼠的微小脑动脉收缩，而Geary[11]和Lew[12]等则发现褪黑素单独作用对大鼠尾动脉血管张力无显著影响。本研究结果发现褪黑素激活BKCa通道，使膜超极化，这与前人研究结果不同。褪黑素产生不同结果的原因目前仍不清楚。我们推测这可能与实验方法不同有关，Régrigny等人将大鼠麻醉后，在体研究褪黑素对脑动脉血管张力的影响，Geary和Lew等采用离体尾动脉观察褪黑素对血管张力的影响，均是对血管组织进行研究。而本研究采用细胞实验观察褪黑素对单个血管平滑肌细胞BKCa通道的影响，未从血管组织层面观察褪黑素的整体影响，这可能是产生不同结果的原因。此外，褪黑素引发的不同结果与动脉的不同有关。Geary和Lew采用大鼠尾动脉作为研究对象，虽然本研究与Régrigny等人的研究对象均为大鼠脑动脉，但Régrigny等人主要以血管壁较薄的微小动脉作为研究对象，而本研究则主要侧重于大脑中动脉，这也可能是产生不同结果的原因。

研究发现褪黑素具有较强的抗氧化应激作用[3]。褪黑素的舒血管作用在L-NAME存在时下降[13]，表明褪黑素可能通过抗氧化作用增强eNOS活性，进而增强血管舒张作用。eNOS催化左旋精氨酸产生NO，血管内皮中NO的产生对BKCa通道起调节作用[14, 15]。为避免内皮细胞对BKCa通道产生影响，本文采用大脑中动脉平滑肌细胞进行研究。非生理条件或者药物干预可显著增加血清褪黑素水平，因此本研究参考Anwar[16]和Da[17]等人采用较高浓度的褪黑素进行观察，较高浓度的褪黑素显著性激活BKCa通道。实验室前期研究发现运动显著增加高血压大鼠褪黑素水平，景会锋等人也报道运动提高2型糖尿病大鼠褪黑素水平，这为运动调节血管张力提供一定的理论依据。此外，褪黑素常作为药物治疗高血压，脑缺血，抑郁等疾病，本研究采用较高浓度褪黑素进行细胞实验，为外源性褪黑素的作用机制提供理论依据。BKCa电流加入褪黑素后电流密度峰值显著增加，而KV通道电流加入褪黑素后无显著影响，表明褪黑素激活BKCa通道，但对KV通道无显著影响。

由于褪黑素具有高亲脂性，能迅速通过细胞膜[18]，因此，我们推测褪黑素不仅通过褪黑素受体间接激活BKCa通道，也有可能直接作用BKCa通道，引起血管舒张。为探讨褪黑素激活BKCa通道的受体依赖途径，本研究采用全细胞和单通道贴附式记录模式观察褪黑素受体阻断剂对BKCa通道的影响。在褪黑素受体阻断剂luzindole作用BKCa通道后，BKCa通道电流无显著影响，表明luzindole本身对BKCa通道无影响，而luzindole孵育后加入褪黑素发现BKCa通道电流增加幅值较未加抑制剂组显著减小，表明褪黑素引起的脑中动脉血管舒张部分是通过MT1/MT2受体激活BKCa通道。这与前人关于褪黑素通过G-蛋白-耦联的膜受体，MT1和MT2两种受体亚型影响血压的研究结果相同[19]。细胞贴附式记录结果发现，Luzindole抑制褪黑素引起的BKCa通道Po值增加，这与全细胞记录结果一致。为了确定褪黑素激活BKCa通道的非受体依赖途径，本研究采用单通道内面向外记录模式观察褪黑素对BKCa通道的直接作用。将细胞钳制在+40 mV，褪黑素使BKCa通道Po值显著增加，并呈浓度依赖性。这与贴附式记录模式结果一致。

综上所述，褪黑素可通过受体依赖途径和非受体依赖途径激活脑动脉BKCa通道，介导大脑中动脉血管舒张。