4,7-二甲基香豆素的合成及潜在靶标

刘润艺，薛礼运，周 化，刘晓玲，梁晓东

(1.深圳万乐药业有限公司,广东深圳518029；2.亿帆医药股份有限公司,安徽合肥230000)

香豆素又名苯并吡喃酮，具有抗菌、抗凝、抗肿瘤、抗癌及消炎等生理活性和光学活性，常用于食品、化妆品、医药、染料及光学等领域，用途广泛。4,7-二甲基香豆素是一种重要的香料和医药中间体，一般由间甲酚与乙酰乙酸乙酯为原料进行合成[1-2]，多用硫酸、磷酸、多聚磷酸等作为溶剂兼催化剂，但这些反应体系较粘稠，不利于大规模生产，且废酸过多，后处理较为麻烦。本实验以间甲酚和乙酰乙酸乙酯为原料，二氯甲烷为溶剂，硫酸为催化剂，采用Pechmann缩合反应合成4,7-二甲基香豆素，用正交实验法[3]优化4,7-二甲基香豆素的最佳合成反应条件。该方法反应条件温和、后处理简单便捷、反应体系均匀，适宜大批量生产，且所用硫酸量较少，对环境更为友好。为探索研究该化合物的潜在药用价值，利用Discovery Studio进行反向模拟找靶，4,7-二甲基香豆素的潜在靶标可能为糖原合成酶激酶-3β。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

间甲酚（工业级，安徽海华科技股份有限公司），乙酰乙酸乙酯（分析级，上海润捷化学试剂有限公司），二氯甲烷（分析级，上海润捷化学试剂有限公司），硫酸（分析级，国药集团化学试剂有限公司），无水硫酸钠（分析级，上海润捷化学试剂有限公司），无水乙醇（分析级，上海润捷化学试剂有限公司），实验用水为蒸馏水。

YRE-201D型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司），YRT-3熔点仪（天津市天大天发科技有限公司），BRUKERAVANCE III HD 400 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司），LC-20A岛津液相色谱仪（日本岛津仪器公司）。

1.2 合成路线

酚和β-酮酸（或酮酸酯）在酸性条件下反应合成香豆素类化合物的反应称为Pechmann反应，反应机理为经酯化（或酯交换）、分子内亲电取代成环、失水得到产物[4-5]，常用质子酸或路易斯酸作为催化剂[6-8]。本文采用间甲酚和乙酰乙酸乙酯作为起始原料，以二氯甲烷作为反应溶剂，硫酸作为催化剂，经Pechmann反应得到4,7-二甲基香豆素，反应方程式见图1。

图1 4,7-二甲基香豆素的合成Fig.1 Synthesis of 4,7-dimethylcoumarin

1.3 正交实验设计

通过预实验得知：硫酸用量、反应温度和溶剂用量对反应摩尔收率可能影响较为显著。因此，本实验以4,7-二甲基香豆素摩尔收率为考核指标，在保持n（间甲酚）∶n（乙酰乙酸乙酯）=1∶1.1的前提下，考察硫酸与间甲酚质量比X1、反应温度X2和溶剂比X3三个因素对反应的影响。具体方案见表1。

表1 实验因素及水平Tab.1 Experimental factors and levels

1.4 实验方法

在装有温度计、干燥管和搅拌子的250 mL三口烧瓶中加入6.3 g（0.058 mol）间甲酚、8.3 g（0.064 mol）乙酰乙酸乙酯和31.5 mL二氯甲烷，搅拌均匀。在5℃（低于反应温度约5℃）下缓慢滴加12.45 g的硫酸，0.5 h滴毕。滴毕后在10℃下保温反应8 h。反应完毕后，缓慢地向反应液中滴入60 mL水，充分搅拌，分出二氯甲烷层。水层以二氯甲烷提取两次（30 mL×2）。合并二氯甲烷层，分别以60 mL水、60 mL饱和碳酸氢钠溶液、60 mL水洗涤，加入无水硫酸钠干燥2 h，过滤，滤液40℃下浓缩至干，得粗品，所得粗品以2倍体积的无水乙醇重结晶，得白色针状结晶。

4,7-二甲基香豆素，熔点132℃（文献值130～132 ℃[1]）。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.48(d,J=8.0 Hz,1H,ArH),7.13(s,1H,ArH),7.10(d,J=8.0 Hz,1H,ArH),6.22(s,1H,CH),2.45(s,3H,CH3),2.42(s,3H,--CH3)。HPLC图谱见图2，纯度99.95%，HPLC归一化法：色谱柱为岛津C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为50 mmol醋酸铵缓冲液（以三氟乙酸调节pH至4.0）与乙腈的体积比为35∶65；流速1 mL/min；检测波长215 nm；柱温35℃。

图2 4,7-二甲基香豆素HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of 4,7-dimethylcoumarin

2 结果与讨论

2.1 实验结果

正交实验结果见表2。

表3为正交实验结果分析。表3中K值（Ki为任意列上水平号为i时所对应的试验结果之和）为各因素水平对指标的总影响，R值（各列中最大K值与最小K值之差）为极差，表明各水平因素对指标的敏感度，极差越大，所对应的因素越重要。由表2可以得知，硫酸用量影响最大，反应温度次之，溶剂用量影响最小。由正交实验得出的最佳反应条件为：硫酸与间甲酚质量比为2.5；反应温度为20℃，二氯甲烷与间甲酚体积质量比为15 mL/g，此时，4,7-二甲基香豆素的摩尔收率可达63.9%。

表2 正交实验结果Tab.2_ Orthogonal experimental results

2.2 反应条件对合成的影响

2.2.1 硫酸用量

在此反应中，硫酸既是催化剂也是吸水剂。Pechmann反应有一分子水生成，硫酸的吸水作用能有效地促使反应向正向进行。硫酸用量过少，反应不能完全进行，摩尔收率较低。从表2可以看出硫酸的最合适用量应为间甲酚质量的2.5倍，如果再增加硫酸，摩尔收率反而下降，可能是因为间甲酚在过量硫酸中发生了磺化反应。因此，硫酸用量应控制在2.5倍左右。

表3 正交实验结果分析Tab.3 Analysis of orthogonal experimental results

2.2.2 反应温度

实验结果表明，在10℃下反应时，摩尔收率较低，可能是反应速率过慢而导致间甲酚未能完全转化。当温度升至30℃时，摩尔收率略微下降，可能是产物在较高温度下发生磺化导致。因此，反应温度应控制在20℃左右。

2.2.3 溶剂用量

从表2结果可以看出，溶剂对摩尔收率影响很小。二氯甲烷量增加时，摩尔收率略有增加，但增量很小。理论上二氯甲烷作为提取溶剂，量越多时提取效果越好，正交实验结果也显示二氯甲烷与间甲酚体积质量比为15 mL/g时摩尔收率最高。从成本考虑，在实际生产中选用二氯甲烷与间甲酚体积质量比为10 mL/g。

3 潜在药物作用靶标探测

糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，以α和β两种亚型存在，参与多种细胞功能[9]。其主要作用是糖原合成酶（GS）的磷酸化，因此GSK-3参与了2型糖尿病的发生[10]。此外，抑制GSK-3可能有助于治疗神经退行性疾病，如阿尔茨海默病[11]和神经疾病，如双相情感障碍[12]。由于GSK-3抑制剂具有很高的治疗价值，寻找和发现GSK-3抑制剂具有很高的实际意义。

3.1 小分子的处理与准备

将Chem Draw绘制的二维结构导入DS（Discovery Studio 2018 Client）窗口中。采用Prepare Ligand工具，将小分子转化为三维结构，再用Full Minimization进行能量最小化处理，此处理会对训练集小分子加氢和赋予CHARMm力场。

3.2 反向找靶

将处理好的分子作为反向找靶的配体，用DS中的Ligand Profiler功能进行反向找靶。在PharmaDB pharmacophores中勾选Shape，添加形状束缚的搜索限制。在Input PharmaDB pharmacophores中Model Selection设置为Most Selective，其中Most Selective便是只搜索每个蛋白的第一个药效团模型，最后点击运行。

3.3 找靶结果

计算机找靶发现5千多个靶标，根据FitValue值，确定靶标的可靠程度，选择打分值较高的前20个靶标（表4），表中具有ShapeSimilarity值的靶标说明4,7-二甲基香豆素与共晶复合物中的配体具有一定的形状相似性，且值越高相似程度越大。综合分析，PDB数据库（Protein Data Bank，蛋白质数据库）中，ID号为3zrl（蛋白质数据库中一种蛋白质）可能为4,7-二甲基香豆素的潜在靶标，此靶标为糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）。

表4 反向找靶结果Tab.4_ Results of reverse targeting

3.4 分子对接

用筛选得到的靶标（PDB：3zrl）进行分子对接，探究4,7-二甲基香豆素与糖原合成酶激酶-3β的分子-蛋白相互作用。

3.5 受体配体的准备

在DS中，通过Prepare Protein进行糖原合成酶激酶-3β蛋白的预处理，给蛋白去水加氢，去除杂原子。将共晶复合物配体的结合位点定义为对接的结合位点，用来进行分子对接（图3），球形部分为结合位点。4,7-二甲基香豆素作为配体，按照反向找靶的方式进行准备。对接过程中将共晶复合物的配体和4,7-二甲基香豆素一起进行对接。

图3 定义的活性位点Fig.3 Defined active site

3.6 对接参数的设置

先通过共晶复合物的配体进行对接，计算RMSD（Root Mean Square Deviation，均方根偏差）值，保证对接参数的可靠性。通过对接结果得出的10个构象与原共晶中的配体对比计算得出RMSD为0.4527，说明对接参数可进行接下来的对接程序。

3.7 对接结果

分子对接能量打分值中，原共晶配体的能量值为-33.110 9，4,7-二甲基香豆素的能量值为-24.737 4（如表5）。

表5 分子对接能量值Tab.5_ Molecular docking energy value

在对接结果中发现，4,7-二甲基香豆素结构中的内酯键的羰基氧与受体中的赖氨酸有氢键相互作用，与天冬氨酸有弱的碳氢键相互作用。此外，4,7-二甲基香豆素结构中的苯环以及甲基与受体中的丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸都有弱的相互作用（图4，5）。

图4 对接结果2D图Fig.4 2D graph of docking result

图5 对接结果3D图Fig.5 3D graph of docking result

4 结 论

以间甲酚和乙酰乙酸乙酯为原料，以二氯甲烷为溶剂、硫酸为催化剂合成4,7-二甲基香豆素，工艺简单，摩尔收率较高。经过正交实验优化的合成条件为硫酸与间甲酚质量比为2.5；反应温度为20℃，二氯甲烷与间甲酚体积质量比为15 mL/g，4,7-二甲基香豆素摩尔收率可达63.9%。产品HPLC纯度99.95%。利用Discovery Studio进行反向模拟找靶，4,7-二甲基香豆素的潜在靶标可能为糖原合成酶激酶-3β。