不同粒径白头翁散破壁率测定及小檗碱溶出度比较试验

李艳玲,卢婷婷,刘永录,张国祖

(河南牧业经济学院制药工程学院,河南 郑州 450046)

白头翁散由白头翁、黄连、黄柏和秦皮组成。其功效为清热解毒,凉血止痢。主治：热毒赤痢,湿热痢疾,赤多白少和发热口渴等[1]。在兽医临床上应用非常广泛。但作为散剂,药材的吸收利用率较低,临床用量较大,对药材资源造成了很大的浪费。

超微粉碎技术是近20年来国际上发展起来的一项应用现代物理或化学方法对材料进行微粉化的新技术,已广泛应用于化工、医药、食品、涂料等众多领域[2]。超微粉碎技术应用到中药制剂中同样显示出独特的优势,研究结果表明,中药粉碎成超微粉后与用传统散剂相比,可明显提高药效和产品质量。目前,兽药市场上也出现了很多超微粉的中成药,但没有统一的检测方法,因为没有统一的标准,所以造成了市场上的鱼目混珠,以普通粉代替超微粉,以次充好,给养殖业带来了很大的经济损失。

本课题拟在充分调研的基础上,以白头翁散为例,对其超微粉碎的最佳粒径做系统的研究,力求制定出能够很好控制超微粉质量的标准。把超微粉碎在中药领域的应用向前推进一大步。

1 材料与试剂

1.1 药材 白头翁、黄连、黄柏、秦皮,购自河南中医学院一附院,经鉴定,白头翁是毛茛科植物白头翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regel)的干燥根;黄连是毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch)的干燥根茎;黄柏是芸香科植物黄皮树(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥树皮;秦皮是木犀科植物苦枥白蜡树(FraxinusrhynchophyllaHance)的干燥干皮;粉碎后分别制成过60目筛、200目筛、300目筛、400目筛、500目筛的细粉。

1.2 标准品 盐酸小檗碱(含量：86.8%,批号：110713-200208,中国药品生物制品检定所);

1.3 仪器 4O0 g摇摆式高速万能粉碎机(型号OFY一400,温岭市林大机械有限公司);依利特高效液相(大连依利特公司);药物溶出仪RCZ-8B(天津大学精密仪器厂);BS-210S型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.4 试剂 甲醇(色谱纯,郑州派尼化学试剂厂);乙腈(色谱纯,郑州派尼化学试剂厂);H3PO4和十二烷基磺酸钠(分析纯,郑州派尼化学试剂厂);盐酸(烟台市双双化工有限公司);三氯甲烷(天津市风船化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 细胞破壁率的测定

2.1.1 细胞计数、标准曲线绘制及最佳浓度选择精密称取0.0152,0.2108,0.3145,0.5256,0.6332,0.7288 g细粉,分别置于25 mL容量瓶中,加水合氯醛约20 mL,超声处理5 min,使粉末分散均匀,用水合氯醛定容至刻度。精密吸取药液30 μL,装片(装片时,使混悬液布满整个玻片,不溢出,无气泡为度),置Wirnier 99显微图像分析仪(40×)下观察。从白头翁散粉末显微特征分析(见图1、2),考察白头翁散微粉的细胞破壁率,宜选择其木栓细胞破壁率的测定。

图1 60目白头翁散显微特征 (4×10)

因此,以白头翁散细粉中完整的木栓细胞为显微特征计数物指标,其多为网状或蜂窝状,此特征具有代表性,进行计数(一个视野为1个计数单位,每个浓度的药液取8个计数单位的平均值)

以白头翁散粉末称样量为横坐标,每个视野中完整的木栓细胞平均数为纵坐标,绘制标准曲线,得出标准曲线方程为Y=30.867X+0.967 5,R2=0.978 8,说明白头翁散细粉中完整木栓细胞在0.105 2-0.728 8 g范围内线性良好,可作为显微特征计数。

2.1.2 白头翁散超微粉细胞破壁率的检测 分别称取白头翁散60目、200目、300目、400目、500目粉,精密称定,按2.1.1所述方法制片,于显微镜下观察。分别观察25个视野,根据两者完整木栓细胞个数、混悬液体积、称样量,计算白头翁散不同粒径下的显微特征个数

白头翁散粉末显微特征个数/mg=XV/V′W

X为每个盖玻片下的特征数,V′为饮片混悬液总体积(mL);V为盖玻片下混悬液体积(mL);W为饮片称取量(mg)。

再根据白头翁散细粉和超微粉的显微特征个数,计算细胞破壁率。破壁率Y=(A-B)/A×100%。Y为细胞破壁率,A为60目白头翁散显微特征个数,B分别为白头翁散200目、300目、400目、500目的显微特征个数。

通过以上公式,计算得出白头翁散200目、300目、400目、500目粒径的细胞破壁率 Y分别为38.64% 、91.94% 、94.99% 、96.95% 。

2.2 小檗碱溶出度的测定 色谱条件：流动相：乙腈：0.05 moL/L磷酸二氢钾溶液(45∶55)(每100毫升加十二烷基磺酸钠0.1 g,磷酸调pH值4.0);色谱柱：依利特 C18柱;检测波长：345 nm;流速：1 mL/min。

表2 白头翁散粉末显微特征(木栓细胞)个数计算的相关参数 (n=25)

采用桨状搅拌器法,溶出介质900 mL 0.1 mol/L稀盐酸,置于溶出杯内,加温待溶出介质温度恒定在37℃(±0.5℃)后,转速为100 r/min,各个粉碎目数样品采样5 g精密称定,自供试品接触溶出介质起立即计时采样。 (2、5、10、20、30、45、60 min)各采样1.5 mL溶出液,立即用滤膜过滤,蒸干,加甲醇10 mL溶解定容,滤过,取续滤液,进样20 μL,测峰面积。 结果见表2,图3、4、5。

图3 小檗碱标准品

图4 白头翁散样品

白头翁散中小檗碱的提取试验结果表明：从60目到500目小檗碱的溶出量(见表3)分别是30.1%、45.5%、82.4%、83.5%、85.9%。 说明由60目到500目,在相同的提取条件下小檗碱的溶出量明显增多,300目和80目、200目相比,小檗碱的溶出均有极显著差异(P＜0.01),但300目和400目、500目相比,小檗碱的溶出量虽有一定的差别,但没有显著差异(P＞0.05)。由表2可以看出,60目和200目的白头翁散中小檗碱的溶出比较缓慢,都是到60 min时溶出量才达到最大。而300目、400目、500目的白头翁散中小檗碱在30 min时就已经达到最大了,虽然随着时间的再延长会略有增加,但差异不显著。并且,300目、400目、500目中小檗碱的溶出速度非常快,5 min时300目、400目、500目的溶出量分别是45.6%、50.1%、53.1%,比60目和200目的白头翁散在60 min时的溶出最大量都多,有着极显著的差异(P＜0.01)

图5 白头翁散超微粉小檗碱阴性

表3 不同粒径白头翁散中小檗碱的溶出度

3 讨论

3.1 关于白头翁散不同粒径细胞破壁率的测定一般认为,超微粉中药的颗粒粒径应在l～75 μm范围内,大多数超微粉中药平均粒径≤15 μm。在《中国兽药典)2015版II部中,对粉末的分级,最细只分到200目(75 μm),并未涉及超微粉( ＜75 μm)粒径的分等及限度[3]。其实在中药领域的超微粉碎,最终的目的是把细胞壁打破[4],以利于有效成分的溶出。因此,破壁率的测定是中药超微粉碎技术的所以白头翁散经过超微粉碎后,找出粒径和细胞破壁之间的关系,确定最佳的粉碎粒径,就可以确定白头翁散超微粉的粒径在什么范围,为控制白头翁散超微粉的质量提供量化标准。。白头翁散显微特征包括石细胞、短纤维、导管、木栓细胞,通过对白头翁散普通粉末及超微粉显微特征的分析,其中木栓细胞呈网状或者蜂窝状,结构典型,适宜作为检测指标进行破壁率的测定。试验结果表明,白头翁散300目的细胞破壁率已达到百分之九十以上,可以作为白头翁散超微粉的制备工艺标准。

3.2 关于不同粒径白头翁散小檗碱溶出度的考察

通常认为,当药物溶出速率成为药物吸收的限制步骤时,药物的生物利用度与药物成分的溶出量和溶出速率在一定程度上具有相关性,通过适当的工艺改变药物的溶出速率就可以提高生物利用度。排除其他因素的影响,从理论上讲,药物的溶出速率主要取决于与溶剂液体接触的颗粒表面积的大小,而表面积与颗粒粒度成反比,所以,药物的粒度越细,其溶出量和溶出速率也应该越快。而300目的白头翁散中小檗碱的溶出总量和溶出速率明显高于200目,但和400目、500目的白头翁散相比,虽然随着时间的再延长会略有增加,但差异不显著。

通过以上试验,我们确定白头翁散粉碎到300目时细胞破壁率已经基本能达到90%以上,且小檗碱的溶出基本能够达到理想的水平。而如果再继续粉碎到400目、500目,其消耗会大大增加,但实际意义不大,因此我们确定白头翁散超微粉的最佳粉碎粒径为300目。

将中药进行超微粉碎后,使有效成分得到了充分利用,丰富了中药的剂型,提高了疗效,和普通散剂相比,大大降低了用药剂量,节约了药材,保护了生态环境,应用于禽病的防治即可混饲,又可混饮,使用方便。如果能在临床上推广应用,必将带来巨大的经济效益和社会效益,为畜牧业的健康发展作出实质贡献。