奇异变形杆菌抑制犬乳腺肿瘤小鼠模型的肿瘤生长和肺脏转移

张 红,贾丽欣,袁瑜璟,张 迪,金艺鹏,林德贵

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193;2.海南大学 热带农林学院,海南 海口 570228)

犬乳腺肿瘤是未绝育母犬最常见的肿瘤,据报道发病率约为200/100,000犬/年[1-2]。由于我国宠物主人对犬绝育的意识较差,导致发病率可能远高于这个比例。患犬可能有一个或多个乳腺肿瘤,研究发现约50%乳腺肿瘤为恶性肿瘤[3]。肿瘤的直径大于1 cm,肿瘤的转移已经发生,手术切除更加容易诱发肿瘤的复发和转移[4-5]。常规的化疗药物对乳腺肿瘤的效果有限,且会造成动物的免疫抑制和其他不良反应,故需要开发更佳的治疗方案来治疗肿瘤病例。

多项研究发现,某些厌氧或兼性厌氧细菌能够在肿瘤的缺氧环境定植和增殖,通过调节机体的免疫反应和争夺营养等方面发挥抗肿瘤的作用[6-7]。奇异变形杆菌是革兰阴性肠杆菌,属兼性厌氧菌,泌尿道的条件致病菌。我们研究发现,奇异变形杆菌(ATCC 35659)能够在犬乳腺肿瘤异种移植小鼠模型的肿瘤内聚集增殖,抑制肿瘤的生长,抑制肺脏转移的发生,可能通过调节机体的局部免疫反应发挥这种治疗效果。

1 试验和方法材料

1.1 荷瘤小鼠模型的制备 使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养(Gibco)CMT-7364犬乳腺肿瘤细胞系,肿瘤细胞达到80% ～90%融合时,胰蛋白酶消化细胞,重悬。将107个CMT-7364犬乳腺肿瘤细胞注射至5月龄雌性BABL/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)的左侧乳房垫内,每周进行观察。

1.2 奇异变形杆菌的准备 奇异变形杆菌(ATCC 35659)由中国农业大学动物医学院药理系馈赠。使用LB肉汤培养基培养奇异变形杆菌,使其达到对数生长期,37℃恒温箱培养24 h,计数细菌单菌落形成单位(CFU),以备后期使用。

1.3 细菌在小鼠体内生物分布的观察 小鼠的乳腺肿瘤直径达到5～8 mm时,随机分为两组,细菌治疗组(BAC)和试验对照组(CON),每组5只小鼠。细菌治疗组尾静脉注射奇异变形杆菌,剂量为5×106CFU/只;试验对照组尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)。于注射后的0 h、24 h和96 h观察小鼠肿瘤的大体变化,在无菌条件下取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肿瘤组织研磨后LB培养基培养细菌,37℃培养24 h后,进行细菌CFU计数。

1.4 异种移植肿瘤的生长情况评估 小鼠的乳腺肿瘤直径达到5～8 mm时,随机分为两组,细菌治疗组(BAC)和试验对照组(CON),每组6只小鼠。细菌治疗组尾静脉注射奇异变形杆菌,剂量为5×106CFU/只,试验对照组尾静脉注射 PBS,每周1次,一共3次。每隔3 d,使用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长和宽,称量小鼠的体重。每周观察小鼠的饮水、饮食、精神状态和身体情况,如发现小鼠出现跛行、极度萎靡或恶病质,脱颈处死小鼠,并记录。21 d治疗结束后脱颈处死小鼠,取小鼠的肿瘤称重,取心脏、肝脏、脾脏和肾脏用福尔马林固定,制备病理组织切片,观察各个器官是否发生病理变化。用福尔马林固定小鼠的肿瘤,脱水,包埋后,进行Ki-67(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),免疫组织化学染色,以评估肿瘤细胞的增殖情况。

1.5自发性肺脏转移情况的评估 21 d治疗结束的小鼠脱颈处死后,取完整的肺脏于福尔马林中固定24 h后,取出计数肺脏表面自发性转移灶的数量。制备病理组织切片,对随机选取的5个视野拍照,Image Plus Pro软件分析肺脏的转移面积。

1.6 ELISA检测 小鼠异种移植的乳腺肿瘤直径达到5～8 mm时,尾静脉注射奇异变形杆菌,剂量为5×106CFU/只。细菌注射后24 h和96 h,眼球放血处死小鼠,采集对照组和细菌治疗组小鼠的血清和肿瘤,肿瘤组织研磨后,进行TNF-α和IL-6细胞因子的酶联免疫吸附测定(ELISA)(购自Abcam公司)。

1.7 统计学分析 上述获得的数据,以平均值±标准差或平均值±标准误来表示。使用GraphPad Prime 5采用单因素方差分析进行数据统计学分析和制图,以P＜0.05为差异显著水平。

2 结果

2.1 细菌能在小鼠异种移植的肿瘤内聚集 恒温箱培养组织研磨液发现细菌能在肿瘤和其他器官被检测到。心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的细菌数量随时间增加而降低,肿瘤的细菌含量随着时间增加而增加,说明细菌能够在小鼠异种移植的肿瘤内特异性地生长和聚集(见中插彩版图1A)。奇异变形杆菌治疗后的24 h和96 h后大体观察发现异种移植的肿瘤发生溃疡(见中插彩版图1B)。肿瘤病理组织学H.E.染色切片显示尾静脉注射细菌后肿瘤细胞发生了死亡和炎性细胞浸润(见中插彩版图1C)。

2.2 细菌抑制肿瘤的生长 根据公式V=a×b2/2(a代表肿瘤的长,b代表肿瘤的宽),计算小鼠异种移植肿瘤的体积,结果显示,细菌治疗组与对照组相比肿瘤体积较小,统计学上差异显著;细菌注射后肿瘤质量显著减轻;免疫组织化学结果显示,细菌治疗后肿瘤细胞的Ki-67表达降低,统计学上差异显著(见中插彩版图2)。上述结果表明,奇异变形杆菌治疗能够显著地抑制小鼠肿瘤的生长。治疗初期细菌治疗组的小鼠体重减轻,但治疗后期体重恢复,两组之间没有显著性差异(见中插彩版图2F),说明细菌治疗在一定程度来说是安全的。

2.3 细菌抑制肺脏自发性转移 21 d治疗结束后,计数肺脏自发性转移灶的数量发现细菌治疗能够显著地抑制肺脏自发性转移灶的形成。分析肺脏转移面积的结果表明,细菌治疗后肺脏转移面积显著减少(见中插彩版图3)。上述结果表明,细菌能够抑制肺脏的自发性转移。

2.4 细菌调节肿瘤局部免疫反应 ELISA检测的结果发现,细菌注射24 h和96 h后血清中IL-6的表达没有明显改变;24 h后肿瘤研磨液的IL-6表达明显升高(P＜0.05)。细菌注射后24 h和96 h后血清的TNF-α表达没有明显改变;细菌注射24 h后肿瘤TNF-α的表达明显升高(P＜0.05)(见图4)。上述结果说明细菌治疗后可能调节肿瘤局部的免疫反应来发挥抑制肿瘤生长和肺脏转移的作用。

3 展望与小结

图4 细菌处理后小鼠血清和肿瘤中IL-6和TNF-α的表达

细菌治疗是个危险的尝试,但我们的研究过程中没有发现奇异变形杆菌对机体造成严重的危害。奇异变形杆菌是条件致病菌,对多种抗生素敏感,如氟喹诺酮类、呋喃妥因、磷霉素、亚胺培南和阿米卡星,能够很好地控制肿瘤治疗过程中出现的副反应[8]。故奇异变形杆菌有望安全地应用于肿瘤临床的治疗或作为载体转运治疗性基因或药物。但临床应用前仍需要对其进行基因改造或其他减毒的措施来保障对机体绝对没有危害。

细菌能发挥治疗肿瘤的作用有多种机制,其中包括免疫调节。有研究表明,细菌治疗能够调节血清和肿瘤中TNF-α、IL-6和IL-12等细胞因子的表达来对抗肿瘤[9]。我们的结果没有发现,血清中这些细胞因子的表达升高,但发现细菌治疗24 h后肿瘤研磨液中的TNF-α和IL-6表达显著升高。这说明奇异变形杆菌可能只是引起局部的免疫反应来发挥抗肿瘤和抗转移的作用。

以上结果表明,奇异变形杆菌可能通过调节肿瘤局部的免疫反应发挥对小鼠异种移植肿瘤的生长和肺脏转移的抑制作用。