HRM技术发展和应用

(南召县动物卫生监督所, 河南 南召 474650)

1 HRM的发展史

HRM技术是近几年来新兴起的一种用于检测单核苷酸多态性的诊断技术。HRM检测技术除了具有高通量、低成本、灵敏性和特异性高之外，真正实现了闭管操作，因此，HRM检测技术深受国内外科研人员的关注并得到广泛的应用。已经商品化的用于HRM检测的仪器是LightScanner，它是由美国Idaho公司生产的专门用于单核苷酸多态性位点的检测的仪器，可以在5min的时间里检测96或者384个样品进行突变位点的检测。此外，市场上其他公司的荧光定量PCR仪器也可以完成对突变位点的检测，如伯乐公司和罗氏公司生产的荧光定量PCR仪可以完成对反应产物的突变位点的检测和基因分型。目前,常用的应用于基因分型的比较准确的方法之一是探针法，但是探针的合成成本比较高，因此，其临床应用也受到极大的限制。而本文所介绍的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描[1]。

2 高分辨率溶解曲线技术的原理

高分辨率溶解曲线技术的原理非常简单，就是在PCR扩增结束后，另设置一个解链的步骤。在温度逐渐上升的阶段，DNA双链由于受到热力作用，碱基之间的氢键会逐步打开，在碱基双链解开到一半的时候，会产生一个解链加剧的点，这个关键点的温度就是DNA双链的Tm温度，在DNA双链逐渐打开的过程叫做溶解。在通常情况下，多用于有效区分GC含量差异较大或者片段长度差异较大的核酸片段时，将溶解曲线温度调整到每秒上升1℃。如有碱基差异较小的情况，那么升温温度一般设置在每秒上升0.1～0.3℃。因此，在温度设置的过程中要考虑到碱基之间的差异的大小。HRM常用的染料主要为饱和燃料、荧光探针和单荧光标记引物。其中饱和染料法较为常见，由于核酸片段碱基之间的组成不同，在温度上升阶段，DNA片段特异性荧光染料在释放的过程中会有差异，根据差异获得基因分型。虽然常用的是饱和燃料，但是不常用于HRM分型的SYBR Green染料仍然可以用于分型上，但是限制在2个片段或GC含量差异较大的基因分型上。荧光探针和单荧光标记引物虽然也能分型，但是不常用[2]。

3 高分辨率溶解曲线技术的研究进展

高分辨率溶解曲线技术可以在DNA溶解过程中产生不一样的溶解曲线图形从而有效区分核酸片段之间的差异，进一步做突变检测和基因分型。HRM基因突变检测方法自被认可以来，得到广泛的应用。

3.1 基因分型

基因分型是HRM检测技术最为常用的一个功能。在这项功能中，笔者不用设计荧光探针就可以达到基因分型的目的。因为不同的核酸片段有不一样的溶解温度，不一样的溶解温度又有不一样的溶解曲线。根据溶解曲线的吻合情况可以有效将野生型和突变型进行有效区分。例如，有学者用HRM技术将人类的β球蛋白的HbS，HbC，HbE 3个基因型进行有效区分。除了临床上应用较为广泛之外，HRM在科研领域也有较多的应用。例如，有学者用HRM技术区分16S rRNA，将细菌进行分类；区分鸡腺病毒血清型进行分型等[3]。

3.2 甲基化研究和应用

甲基化在机体正常的生命活动中起着非常重要的作用。核酸的甲基化是指核酸在甲基化转移酶的调节下，在基因组CpG岛的CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位点共价键结合一个甲基团，甲基化是哺乳动物基因表达的调控方式之一。核酸的甲基化状态改变后，基因的结构和功能就会有很大的变化。溶解温度之间的差异能够反映出同原序列之间的差异。核酸片段经过亚硫酸氢盐的处理，没有甲基化的胞嘧啶成为尿嘧啶，尿嘧啶在扩增过程中可以转化成胸腺嘧啶。这样，甲基化和非甲基化就可以转化成核酸片段之间的差异，进而有效区分甲基化和非甲基化。高分辨率溶解曲线技术在甲基化的检测中检测灵敏度非常高，即便是0.1%的甲基化程度也能检测出来。

3.3 突变扫描

HRM技术也常用于突变位点的筛查和发现新突变位点。早期Smitn研究发现，一名肺癌患者的表皮生长因子发生突变，突变位点在第四号外显子上。此后不久，另一科学家将HRM技术进行可改进，用于非小细胞肺癌患者的表皮生长因子的扫描。之后，越来越多的科学家发现，应用HRM检测技术检测侧出突变位点与某些疾病的发生有很大的关系。例如:BRCA1和BRCA2的突变被证实与乳腺癌有关。另一位学者同样用HRM技术对收集的结肠癌患者的样本进行检测，发现检测结果与金标准方法测序结果的吻合度达到95%。

[1]杨彩虹,杨敏,于璐,等.高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测[J].中国人兽共患病学报,2017(05):403-412.

[2]王海英,刘志敏,郑建礼,等.结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究[J].齐鲁医学检验,2005(05):3.

[3]周长凯,曹婧.结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分子机制[J].中国微生态学杂志,2013(06)：731-732+73.