拟南芥WRI1转录因子对酿酒酵母脂肪酸合成的影响

闵文莉,曹喜涛,,季更生,*,屠 洁,,李 强,,陈 欣,,张国政,,武国华,

(1.江苏科技大学 生物技术学院, 镇江 212018) (2.中国农业科学院 蚕业研究所, 镇江 212018)

脂肪酸是最简单的一种脂,由碳氢氧三种元素组成,是许多更复杂的脂的组成成分,如细胞膜上的磷脂为机体提供能量的甘油三酯等．根据碳氢链饱和程度,脂肪酸可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸,在生物体的许多生理活动中有着必不可少的作用．脂肪酸及其衍生物主要用于制造日用化妆品、洗涤剂、工业脂肪酸盐、生物柴油、油漆、橡胶、肥皂等[1],具有广泛的应用价值．

转录因子是植物体中环境胁迫应答反应所激发产生的一类蛋白,也称为反式作用因子,其通过功能结构域与启动子顺式作用元件或其他转录因子发生特异性相互作用以激活或抑制基因转录[2-3]．植物中调控脂肪酸合成与油脂积累的转录因子有多种,包括WRINKLED1(WRI1)、GmDOF4/GmDOF11、FUSCA3(FUS3)及LEAFY COTYLEDON 1(LEC1)等,而其中的WRI1蛋白是植物特有的一类转录因子,主要在脂肪酸合成与糖酵解后期发挥调控作用[4-6],对植物油脂的合成与积累起到了关键作用．近年来,WRI1蛋白在植物中的研究与应用已成为热点之一,相关研究表明WRI1可以不同程度地提高作物产油量[7],但是WRI1在微生物中的研究目前还未见报道．本研究通过WRI1转录因子在真核表达系统中进行表达,分析了拟南芥转录因子AtWRI1表达对酵母脂肪酸合成的影响,以期望为未来微生物合成脂肪酸奠定基础．

1 试验

1.1 材料

(1) 试剂及仪器

拟南芥Arabidopsis thaliana cDNA为本实验室提取;Taq 酶、DNA连接酶、限制酶、T 载体均购自TAKARA公司；逆转录试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、LB 培养基购自生工生物工程(上海)有限公司;参照文献[8]配制YPD 培养基及SD培养基;脂肪酸甲酯混合标准品从Sigma公司所购．所用仪器:2720 Thermal Cycler PCR 仪;国产DYCP-31E型电泳仪;美国布鲁克320GC-MS气质联用仪．

(2) 引物、质粒及菌株

根据拟南芥WRI1基因Atwri1(GenBank Accession NM-202701)设计引物,上游、下游引物分别命名为Atwri1-F、Atwri1-R,并分别引入Spe I、BamH I酶切位点(下划线),引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,序列如表1．大肠杆菌Top10、宿主菌酿酒酵母BY4742、质粒p416-MET25为本实验保存．

表1 实验所用引物、质粒及菌株

1.2 方法

(1) Atwri1基因的克隆

以拟南芥Atwri1 cDNA为模板,加入引物Atwri1-F、Atwri1-R、Taq酶、dNTPs进行PCR扩增．反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;72 ℃ 90 s;30个循环;最后72℃延伸10 min．反应结束后以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行胶回收．

(2) 构建重组T载体pMD18-Atwri1

将T载体及胶回收后的目的基因片段按照一定比例连接,得到的重组T载体转化大肠杆菌TOP10 感受态细胞,涂布于含氨苄抗生素的LB平板上,37 ℃恒温过夜培养,挑取抗性单克隆菌落培养2～3 h,以pMD18-T载体的上下游通用引物RV-M和M13-47进行菌液PCR初步验证．经过初步验证后的重组菌株在液体LB培养基中扩大培养,将菌液送至上海生工测序进行最终验证．

(3) 构建重组质粒p416-Atwri1

将重组大肠杆菌接入液体LB培养基中、37 ℃条件下培养过夜,取过夜培养物分别提取重组T载体、p416-MET25质粒,分别进行Spe I和BamH I双酶切反应,胶回收后Atwri1片段与p416-MET25质粒按照一定比例连接,得到的重组质粒p416-Atwri1转化大肠杆菌TOP10 感受态细胞,涂布于含氨苄抗生素的LB平板上,37 ℃恒温过夜培养,挑取抗性单克隆菌落培养2～3 h,以表1中p416-MET25质粒引物Atwri1-F/Atwri1-R进行菌液PCR验证．

(4) 重组质粒p416-Atwri1的转化与鉴定

将上述所得菌株进行过夜培养,提取重组质粒p416-Atwri1,用LiAc/PEG化学转化法将重组质粒转化至BY4742酿酒酵母中,将重组酵母命名为C-20,涂布于营养缺陷型SD培养基上,30 ℃培养2～3 d,挑取单克隆菌落于液体SD培养基中,培养至菌液浑浊时取5 μL置于EP管中,加入20 μL 0.02 M NaOH,100℃沸水浴15 min后立即放入冰中,取1 μL作为模板用于PCR验证,同时以转化p416空质粒的酵母菌作为空白对照,对照组重组酵母命名为CK-20．

(5) 重组酵母生长曲线的检测

配制碳浓度为20 g/L的发酵液,把种子液接入发酵液中,使发酵液初始OD600值为0.05[9-10],以空质粒重组酵母菌做空白对照,30 ℃、150 r/min培养,分别在0、4、10、16、22、28、34、40、46、52和58 h时取样检测OD600,根据OD600和时间作出重组酵母的生长曲线．

(6) 脂肪酸的甲酯化

配制碳浓度为20 g/L的发酵液,把种子液接入发酵液中,使发酵液初始OD600值为0.05,以空质粒重组酵母菌做空白对照,30℃、150 r/min培养,在96 h时取样．取20 mL发酵液,经过浓盐酸破壁后,加入10% HCL-甲醇溶液62℃水浴处理3 h,最终加入正己烷进行提取,取正己烷层用于样品检测[11]．脂肪酸混合标准品用正己烷进行溶解,稀释到10 ppm的浓度,置于-20℃待测．

(7) 脂肪酸的检测

用气质联用法(GC-MS)检测重组酵母中脂肪酸的种类及含量,用以评估WRI1转录因子对酿酒酵母合成脂肪酸的影响,色谱条件如下[12]:毛细管柱为HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 mm),载气为高纯氦气(99.999%),进样器温度280 ℃,离子源温度200 ℃,载气流速1.1 mL/min,溶剂延迟时间为3 min,进样量1 μL,程序升温条件为:初始温度100 ℃保持4 min,以8 ℃/min 的速度升温至280 ℃,保持3 min．

通过样品与标准品色谱图中峰面积的比对,计算样品中脂肪酸的含量,计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 Atwri1基因的克隆

以拟南芥cDNA为模板,PCR扩增后得到约1 100 bp的片段,电泳图如图1,大小与拟南芥WRI1基因预测值相符, 说明目的基因克隆成功．

图1 Atwri1基因的电泳图Fig.1 Electrophoresis map of Atwri1 gene

2.2 重组T载体及重组质粒的构建与鉴定

Atwri1基因片段插入T载体及表达载体,进行菌液PCR验证及重组质粒双酶切验证(图2)．重组T载体经DNA测序,所测序列与GenBank序列比对完全一致,说明Atwri1基因扩增成功．

图2 重组质粒p416-Atwri1的双酶切验证Fig.2 Restriction enzyme analysis of therecombinant plasmid p416-Atwri1

2.3 重组质粒的转化

将重组质粒用PEG/LiAc化学转化法转化酿酒酵母BY4742中,从平板上挑取的阳性菌落经SD培养基培养3 d后,以AtWRI1-F/Atwri1-R为引物进行菌液PCR验证,证明了重组质粒p416-Atwri1成功转化进酿酒酵母,重组菌构建成功．

2.4 AtWRI1对重组酵母生长的影响

重组酵母生长曲线如图3,重组酵母均在34 h左右进入稳定期,OD600在5以下,总体菌液浓度之所以不高,可能是由于碳源的快速消耗以及产生了大量乙醇对酵母生长产生了抑制作用．在指数期,重组酵母明显比空质粒酵母菌生长迅速,可能是由于AtWRI1转录因子激活了一些与脂肪酸合成和糖酵解有关的基因的转录[13-15],如β-淀粉酶、酰基载体蛋白ACP1等,从而促进了重组酵母的生长．

图3 重组酵母的生长曲线Fig.3 Growth curves of recombinant yeast

2.5 脂肪酸的检测分析

使用气质联用仪检测脂肪酸的含量及种类(图4),在酿酒酵母中过表达Atwri1基因,脂肪酸的含量及种类均发生了变化．从色谱图可以看出,重组酵母与对照菌均主要含有9种脂肪酸,分别为丁酸(C4 ∶0)、辛酸 (8 ∶0)、癸酸(10 ∶0)、肉豆蔻酸 (14 ∶0)、棕榈酸 (16 ∶0)、棕榈油酸(16 ∶1)、油酸 (18 ∶1)、硬脂酸 (18 ∶0)、花生酸(20 ∶0),除此之外,仅仅对照菌含有十五烷酸(C15 ∶0),说明WRI1转录因子改变了菌体合成的脂肪酸种类．

图4 GC-MS分析酿酒酵母中的脂肪酸Fig.4 GC-MS analysis of fatty acids fromSaccharomyces cerevisiae

与野生菌相比,重组菌p416-Atwri1合成肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、硬脂酸、花生酸的能力分别为196.3%、38.6%、20.3%、25.9%、95.6%、102%．长链脂肪酸的总含量增加了44.8%,长链脂肪酸的产量在总脂肪酸产量中所占比例高达73.8%,高出野生菌33%．

酿酒酵母中合成的主要脂肪酸为C16及C18的饱和及不饱和脂肪酸,如图5,表达了WRI1蛋白的酵母C-20合成长链脂肪酸的水平均比对照组酵母CK-20有所提高．本实验未对拟南芥WRI1基因进行密码子优化,直接用于酵母中进行脂肪酸合成的调控,另外实验使用的表达载体p416-MET为低拷贝质粒,拷贝数有限,使得WRI1蛋白的表达量在一定程度上受到限制,但仍可看出WRI1蛋白调控脂肪酸合成的潜力．

图5 重组酵母中脂肪酸的合成水平Fig.5 Fatty acids production levels in therecombination Saccharomyce. cerevisiae

3 结论

合成生物学方法构建高产脂肪酸微生物成为热点之一,已有在大肠杆菌中构建脂肪酸合成通路的报道[17],但大肠杆菌表达体系有些不足之处,如表达蛋白往往缺乏修饰,不宜表达真核基因;蛋白后期处理成本增加;很难表达大量可溶性蛋白等．而酿酒酵母作为真核模式生物,有效地避开原核表达系统的缺点,并且由于其基因组已知、代谢背景清晰、耐酸碱、易于培养等特点被广泛应用于工业生产,WRI1转录因子在酿酒酵母中的研究应用可为获得高量生产脂肪酸的微生物菌株奠定基础．

本实验首次在酿酒酵母中成功表达了植物转录因子,提高了长链脂肪酸的含量,有利于工业化、规模化生产油脂．在酿酒酵母中表达拟南芥WRI1基因为调控脂肪酸合成做铺垫,后续实验会继续着重于提高酿酒酵母中脂肪酸的合成,除了代谢改造外,还可克隆油料作物(如大豆)中的WRI1基因并应用于酿酒酵母,以及利用WRI1蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达对重组酵母中的WRI1转录因子进行细胞定位及功能分析．油料作物中的WRI1蛋白对脂肪酸的合成与油脂积累起到了关键作用,若能在微生物中成功运用,将使微生物菌株得到更广泛地应用．