微小组织病理技术

杨旭

（湖北省恩施州动物疫病预防控制中心，恩施 445000）

0 引言

病理技术是病例诊断的前提，同时也是病理研究领域的重要方法学，因此在生物医疗活动中发挥十分关键的作用。然而由于当前各种针吸检查与内窥镜检查的普遍应用，使这些检查送检的标本数量不断增加，这些标本均呈现米粒状、针尖状等。对微小组织进行制片的过程十分复杂，极易导致组织缺失或掺杂别的组织，使标本被污染，因此需要在病理技术方面进行改进。

1 微小标本预处理方法

对微小活检组织的预处理十分重要。合理的预处理能缩短制片时间，最大限度还原组织形态和病理特征，做出准确诊断。郑玉琴[1]研究发现，对微小组织标本的固定效果，对病例诊断的准确程度产生较大的影响。很多内窥镜均是通过多点取材的方式，组织标本延搁予滤纸上面，无法有效固定，易导致一些微小组织标本由于标底滤纸吸水，组织标本牢固地吸附于滤纸上面不能分离，即使强行将其取下，也会粘带肉眼不可见的滤纸纤维，极大地影响微小组织的固定，使切片很容易碎裂，降低诊断的准确性。借助光面白纸可以处理标底纸对组织标本吸水过多、防止微小组织不易同衬底分离、粘带纸纤维等情况。避免制片中的组织出现碎裂的情况，提高制片质量。微小组织能与普通外科手术标本共同浸蜡、脱水，不用专门解决，使操作流程更加简便。掌握微小组织的固定、脱水等预处理流程，便可得到完整、清楚的微小组织切片，有效地提升诊断与组织标本分类、分型的准确程度。

2 微小组织快速冰冻切片法

由于科学技术的快速进步，冰冻切片不断成为病理科众多工作中重要内容之一，为进行准确的术中诊断提供基础。由于医疗技术水平的日益提升以及医学技术的逐渐发展，使人们越来越关注健康的重要性。临床医生与病人要求对直径3 mm以下的微小组织进行迅速正确的诊断，由于这些组织的体积过小，对其进行制片与诊断并不容易，阻碍该项工作的实施。为更好地处理该问题，研究人员做了大量探索、改进，取得一些进展。微小组织在冰冻切片中的包埋是一大难题，用半导体切片机通过琼脂包埋，使微小组织或破碎组织不仅能进行冰冻切片，而且切片形态保持完整，效果较好。梁忠泉[2]等使用甲基纤维素替代OCT包埋剂，并将原组织包埋托进行完善，令切片刀同组织包埋托的接触面积不断减少，有利于对组织标本进行观察，不会破坏刀口，修切时应避免把组织样本切完。在被打湿的小滤纸片上滴少量液体胶，再把微小组织平放于滴有少量液体胶的小滤纸上方，最后放于冷台上冷冻3～5 min再实施切片。

3 微小组织石蜡包埋切片法

石蜡块可以长时间保存，良好的微小组织切片既能给临床科室与病人提供充足的时间，还能有效地提升临床诊断与组织样本分类分型的准确程度。微小组织由于组织体积小，通过脱水等相关处理后，会逐渐缩小，因此容易丢失。脱水后组织颜色为灰白色，不易被发现，特别是包埋后与蜡的颜色相近，导致切片时不容易发现组织。将组织放入微孔包埋盒中，立即投入含有2%伊红、0.9%氯化钠溶液中，浸泡30 min左右，使组织着色。用擦镜纸将固定好的微小组织包裹，放入包埋盒中进行脱水。微小组织由于体积较小，脱水时间与常规脱水时间不同。采用超声微波法，分别将100%乙醇、丙酮以及二甲苯放在预热铝板上进行脱水、透明，以缩短脱水透明时间。将95%乙醇、无水乙醇、二甲苯放入80 ℃烘箱中以缩短脱水透明时间。蜡块包埋时，较小组织不易将其包埋在中间，采用预包埋法，将微小组织先用熔化的蜡液包埋，利用后加注的蜡液温度将预包埋的蜡逐渐熔化，冷却成型后，使组织与蜡完全融为一体，使其固定于包埋模中央，便于切片。对细针穿刺微小组织进行滴胶石蜡双重包埋的方法，该方法对细胞学诊断具有较高的实用价值。将合成胶水作为预包埋材料，主要是考虑到针吸组织的体积小，不利于寻找，直接石蜡包埋十分复杂，只有进行预包埋后，使组织微粒裹成型，体积变大，有利于脱水、透明操作。合成胶水为高分子化合物，主要是借助淀粉通过酸化或热处理后生成的糊精样产物，极易溶解在热水中，但不能溶解在乙醇中，按照该特性把通过胶水包埋的组织投放入乙醇中，在脱水时胶滴不断凝聚成型，有助于进行石蜡双重包埋，操作便捷。微小组织必须借助伊红指示着色，进而在包埋后有助于判断其同附近蜡面的界限与预测切片的深度，而且，切片刀较为锋利，在操作时应该小心、谨慎，借助微调手轮对露出的切面进行修整。滴胶预包埋借助凹孔有机玻璃板把微小微粒组织集中到同一个平面上，使其不易分散、漂浮，避免切片不完整导致漏诊情况的发生。通常针吸微小组织滴胶包埋后应该借助单独脱水的方式，由于胶滴在凝固后密度增加，同时组织包裹中的水很难渗透出来，因此浸蜡、脱水以及透明需要合理增加时间，确保制片的效果[3]。

4 微小组织HE染色和免疫组化研究

由于微小组织体积小，因此对染料渗透性较好。改进传统的HE染色步骤，先将微小活检组织进行HE染色，之后进行系列脱水、包埋、切片。用纸片将每个送检微小组织连同病理编号一起包好，滴加伊红染液，用钢圈固定后进行微小组织的固定、脱水、透明、浸蜡，制作的蜡块能连续切片，蜡带舒展、良好，展片无皱褶，HE染色后各种细胞成分着色鲜艳，能满足诊断的要求。微量组织的HE染色时需用热水反蓝，既能预防细胞核退行性染色过度，又能将组织边缘多余的包埋试剂（如胶质）残留污渍清洗溶解，使切片明亮洁净。

微量组织进行组织化学染色虽然无特殊之处，但是对于微量组织组化操作依然需要谨慎对待。如组织过小，操作中易脱落，因此需控制好操作时间和力度。在实验室常规操作中对微量组织的组化操作进行一系列优化：第一，切片烘烤要充分，否则组织微粒甚小、附着力较差容易造成脱片；第二，在梯度酒精水化步骤适当缩短时间；第三，缩短抗原修复时间；第四，孵育微量抗体时加盖盖玻片，防止少量抗体挥发，使有限的抗体覆盖均匀。同时，应该也探索微量组织的高通量和组织芯片组操作技术，将数十至上百个甚至更多小的组织整齐有序地排列在一张载玻片上制成缩微组织芯片，即组织切片。这样既充分利用切片的空间，又节省操作时间，还可以对大量组织进行同一化操作，使试验结果更具有可比性，增强免疫组化结果的可信度和正确性。

5 结束语

微小组织病理切片制作是对病理技术的一大考验。使用有颜色的染料将组织染色，在组织包埋中易于识别，极大地提高包埋速度和质量。而且染色组织在白色蜡块中非常醒目，容易掌握蜡块的切修深度，确保切片的质量，便于病理诊断。随着医学科学技术的不断提高，所取组织的体积将会越来越小，因此需要不断地提高病理技术，为病理诊断提供优质的切片。充分了解微小组织的固定、脱水浸蜡、包埋、冷冻、切片和染色等几个方面的程序，便可以制出组织完整、清楚以及色泽鲜艳的微小组织切片，以期有效提升诊断与组织分类分型的准确程度。