湖北省烟草赤星病菌生物学特性研究

黎妍妍 杨涛 贾欣欣 郑露 黄俊斌 许汝冰 周鹏 李锡宏

摘要：对湖北省烟草赤星病细极链格孢（Alternaria tenuissima）、链格孢（Alternaria alternata）、长柄链格孢（Alternaria longipes）和鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）4种链格孢属致病菌的代表性菌株进行了生物学特性分析，并分析了不同温度和保湿时间对长柄链格孢菌致病力的影响。结果表明，4种链格孢菌最适宜的生长温度为25～30 ℃;长柄链格孢最适宜的pH为5～6，其他种的最适宜生长pH为6～8。在不同碳源中，以甘露醇和半乳糖作为碳源时鸭梨链格孢生长最快，乳糖、葡萄糖等5种碳源最适宜链格孢生长，长柄链格孢在各种碳源下均生长最慢。在不同氮源中，除长柄链格孢的最适氮源为氯化铵外，其他3种链格孢在蛋白胨作为氮源时生长最快。不同种的链格孢属致病菌的致病力存在差异，除鸭梨链格孢菌株表现为弱致病力外，其他3种链格孢均存在强致病力菌株。不同温度及保湿时间对长柄链格孢菌致病力具有显著影响，最适发病温度为25～30 ℃，保湿时间与病害严重度呈正相关。

关键词：烟草赤星病;链格孢（Alternaria alternata）;生物学特性

中图分类号：S435.72         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）22-0027-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.009           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Biological characteristics of representative strains of four Alternaria spp. （Alternaria tenuissima，Alternaria alternata，Alternaria longipes，Alternaria yaliinficiens） and the effects of temperature and wetness duration on pathogenicity of Alternaria longipes were studied. The results showed that the most suitable temperature for Alternaria spp. growth was 25～30 ℃. The most suitable pH for the growth of Alternaria longipes and the other three species were 5～6 and 6～8，respectively. When mannitol and galactose were used as carbon sources，Alternaria yaliinficiens grew fastest;And other five carbon sources，such as lactose and glucose were most suitable for the growth of Alternaria alternata;Alternaria longipes grew most slowly under all carbon sources. The effect of different nitrogen sources on the growth showed that the Alternaria longipes grew fastest when ammonium chloride was used as nitrogen source，and the other three species grew fastest when peptone was used as nitrogen source. Virulence of four species was tested，and the results showed that the virulence of four species of Alternaria spp. were different. Among them，Alternaria tenuissima，Alternaria alternata and Alternaria longipes had strong virulence strains，while the strains of Alternaria yaliinficiens showed weak virulence. Different temperatures and wetness duration had significantly influence on the virulence of Alternaria longipes. The optimal temperature for disease was 25～30 ℃，and wetness duration was positively correlated with disease severity.

Key words： tobacco brown spot disease; Alternaria alternata; biological characteristics

煙草赤星病是危害全世界烟草生产最主要的真菌性病害，其病原菌属于半知菌类链格孢属[1]。中国于1916年首次在北京近郊发现该病，20世纪80年代以来，全国烟区有日益严重的趋势。1990年以后，该病在国内迅速发展成为烟草上的主要病害之一[2-5]。

烟草赤星病的发生和流行受不同环境条件的影响，其致病力在不同区域也呈现出不同的特点。刘学敏等[6]和曾琛等[7]研究发现降雨量及降雨日数、日平均温度、日平均相对湿度、初始病情是导致其发生、暴发流行的最重要因素。很多学者对烟草赤星病链格孢种的致病力研究结果不同，彭希文等[8]对链格孢（Alternaria alternata）和长柄链格孢（Alternaria longipes）两种链格孢属致病菌的致病力进行了测定，发现链格孢的致病力强于长柄链格孢，且链格孢种间的不同菌株致病力有显著差異。张世才[9]研究结果相反，但也有学者认为只有长柄链格孢菌株才具有致病力[10]。

湖北省烟草赤星病菌由细极链格孢（Alternaria tenuissima）、链格孢、鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）和长柄链格孢4个种引起[11]。其中，长柄链格孢是优势致病菌，且在湖北省各个烟区都有分布。为深入了解病原菌生长、侵染及危害的特点，本研究拟通过分析不同温度、pH、碳源和氮源对4种链格孢属致病菌菌丝生长的影响，并通过分析4种链格孢属致病菌的致病力差异和不同温度及保湿时间对长柄链格孢致病力的影响，以期为烟草赤星病病害流行监测与防控奠定科学的理论依据。

1  材料与方法

1.1  供试菌株

链格孢（YC-WF-750-2）、细极链格孢（SY-FX-700-1）、鸭梨链格孢（ES-BD-1100-1）和长柄链格孢（XY-BK-800-2）4个代表性菌株，研究不同温度、pH、氮源、碳源对菌株生长的影响。

选取17个链格孢属致病菌代表菌株用于不同种致病力差异研究;5个长柄链格孢菌株（YC-WF-1200-3、YC-WF-1200-4、XY-BK-800-2、SY-ZS-600-2、SY-ZS-700-1）用于不同温度和保湿时间对菌株致病力的影响。

1.2  供试植物

采用漂浮育苗方法播种云烟87，在28 ℃光照/黑暗各12 h的培养箱中长到7～10叶期的健康烟草叶片用于致病力测定。

1.3  不同生长条件对链格孢属致病菌菌丝生长的影响

1.3.1  不同温度条件对菌丝生长的影响  在生长7 d的菌落边缘用直径6 mm打孔器打取菌丝块，接种于PDA培养基上，每个皿接一个菌丝块。将平板分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃全黑暗恒温培养箱中培养，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径并记录数据，各温度处理重复6次。

1.3.2  不同pH对菌丝生长的影响  用灭菌的0.1 mol/L氢氧化钠溶液和0.1 mol/L盐酸溶液调节PDB培养基，pH分别为4、5、6、7、8、9、10，打取生长7 d的菌落边缘直径为6 mm的菌丝块接种于PDB培养基平板中央，置于全黑暗25 ℃恒温培养箱中培养，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径并记录数据，各处理重复6次。

1.3.3  不同碳源对菌丝生长的影响  以Capek培养液（0.5 g MgSO4·7H2O，2.00 g KNO3，0.01 g FeSO4，1.00 g KH2PO4，0.5 g KCl，30.0 g蔗糖，补足1 000 mL去离子水）为基础，加15 g琼脂，用等质量碳元素的乳糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖、淀粉替代蔗糖，以不加碳源的培养基作为培养菌对照。接种、培养及测量方法同“1.3.2”。

1.3.4  不同氮源对菌丝生长的影响  以Capek培养液为基础，加15 g琼脂，用等质量氮元素的蛋白胨、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钾、乙酸铵、甘氨酸替代硝酸钾，以不加氮源的培养基培养菌作为对照。接种、培养及测量方法同“1.3.2”。

1.4  不同种烟草链格孢属致病菌的致病力测定

将4个种的17个代表性菌株转至PDA培养基上，置于22 ℃、光暗交替的恒温培养箱中培养，7 d后在菌落边缘打取直径为6 mm的菌丝块，接种到7～10叶期的离体健康烟草叶片上，在25 ℃、12 h光照12 h黑暗的恒温培养箱中保湿培养3 d后测量接种点的病斑直径。试验共重复3次。

根据张明厚等[12]的分级标准来评价各菌株致病力的强弱。病害严重度及致病力强弱依据病斑直径进行划分：0，无病症，不致病;1，病斑直径0～0.5 mm，致病力弱;2，病斑直径0.5～2.0 mm，致病力中等;  3，病斑直径2.0～5.0 mm，致病力较强;4，病斑直径  >5.0 mm，致病力强。

1.5  不同条件对长柄链格孢致病力的影响

挑选致病力强的5株长柄链格孢菌用于研究不同保湿时间对病原菌的致病力影响，在PDA培养基上培养7 d后，在菌落边缘打取6 mm的圆形菌丝块，接种在育苗桶（400 mm×300 mm×500 mm）中生长至7～10叶期的烟草叶片上。

1.5.1  不同温度对长柄链格孢致病力的影响  分别置于15、20、25、30和35 ℃恒温保湿、光暗交替（12 h/12 h）的培养箱中培养3 d后，统计发病情况。

1.5.2  不同保湿时间对长柄链格孢致病力的影响

接种后喷水用保鲜膜密封保湿置于28 ℃、湿度75%、光暗交替（12 h/12 h）的恒温培养箱中培养，分别在1、3和5 d后揭开保鲜膜，测量发病病斑直径。每个菌株接种10片烟草叶片，试验重复3次。

1.6  数据统计与分析

试验数据用SPSS软件（V6.12）分析，并用最小显著差数法（LSD）比较不同处理的显著性差异。