SBR反应器中C60对活性污泥的影响

郭洪霞

(安徽三联学院 教务处， 安徽 合肥 230601)

随着纳米材料的大规模生产和应用，纳米材料对人类健康及生态环境都有负面影响[1-4]，其环境效应和安全性受到高度重视[5.6].作为应用最广泛的磷纳米材料之一，富勒烯存在潜在环境和健康风险[7]，对细胞[8,9]、微生物[10,11]、水生生物[12-14]等均有毒性作用.C60水悬液会引起土壤中微生物群落的持续低水平变化[15]，C60颗粒状或水悬液对土壤微生物群落的结构和功能均无显著的毒性作用[16].富勤烯能在环境介质中进行迁移而污染水份，国内外尚无此类研究.本文以四氢呋喃法制备的C60水悬液对SBR中活性污泥的影响为研究目的，通过对活性污泥生化特性的监测，并利用PCR-DGGE技术来考察微生物群落结构的变化，以及C60内对活性污泥的影响，以期为富勒烯的合理开发和利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试剂：C60、三水合乙酸钠、氯化铵、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、氢氧化钠、甲苯等均为分析纯.

活性污泥：本试验使用的污泥取自合肥市望塘污水处理厂的回流池，经人工配水驯化一周后开始试验.

人工配水：本试验所用的原水为人工配水，即在自来水中加入一定量的营养物质配制而成.以乙酸钠为碳源，使进水COD=500 mg/L；具体营养物质及含量如下： NH4Cl 95 mg/L；K2HPO4·3H2O 30 mg/L；CaCl225 mg/L； MgSO420 mg/L，这样可保证配水中营养物质符合微生物生长比例CNP=10051，并加入适量的微量元素.

1.2 试验方法

1.2.1 C60标准曲线绘制

精确称取20.70 mg C60溶于50 mL甲苯中，转移至100 mL容量瓶中定容至刻度，配置成标准贮备液.准确移取10.00 mL标准贮备液置于100 mL量筒中并用甲苯定容，配置成标准使用液.分别移取体积为 2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL C60标准使用液置于25 mL比色管中，用甲苯溶液稀释至20.00 mL.以甲苯溶液为空白，在330 nm处测定吸光度.以浓度对吸光度作图，绘制C60标准曲线.

1.2.2 C60水悬液的制备与表征

称取4 mg C60纳米颗粒溶于250 mL四氢呋喃中，磁力搅拌24 h，经0.45 μm有机滤膜过滤.将滤液缓慢加入到迅速搅拌着的等体积蒸馏水中，形成淡黄色悬浊液；将此悬浊液进行蒸馏以去除四氢呋喃，蒸至约300 mL，加蒸馏水200 mL继续蒸馏至体积减半，如此反复两次之后，将C60水悬液浓缩至100 mL左右.对制备的水悬液进行紫外可见吸收光谱 (UV-Vis) 分析及粒径分布表征，C60稳定水悬液经高氯酸处理和甲苯萃取后，萃取液在330 nm处测定吸光度，确定C60水悬液的浓度.

1.2.3 C60水悬液对活性污泥影响

试验在均为2.5 L的4个序批式(SBR)反应器中进行.试验前将驯化好的污泥曝气24 h，以耗尽所有外源基质，然后用自来水、蒸馏水各清洗三次，以去除溶液中的残留底物以及代谢产物等，最后将反应器中的活性污泥浓度MLSS调整到2 000 mg/L 左右.向1、2号反应器(实验组)中各加入200 mL制备好的浓度为48.27 mg/L的C60水悬液，同时向3、4号反应器(对照组)中加入等量的蒸馏水作为对照组，这样每个反应器中有机底物的浓度相等.控制反应器曝气量为0.4 m3/h，SBR反应器在20 ℃条件下运行，反应周期为6 h，并间隔一定时间取适量的污泥混合液以溶氧仪测定耗氧速率(OUR).同时，监测水样中总有机碳以及氨氮的降解情况，反应结束后提取污泥样品的DNA，采用PCR-DGGE确定活性污泥中微生物菌群结构的变化.

1.2.4 PCR扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

接种活性污泥及反应器中的活性污泥经DNA提取试剂盒分别提取基因组DNA.使用细菌通用引物F338 (5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')和R534 (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')，正向引物F338的5' 端连有一个40 bp富含GC的序列(5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCACGG GGG G-3')，扩增16S rRNA基因的V3区域.PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.DGGE分析采用8%聚丙烯酰胺，30%～50%变性剂，以75 V和60 ℃使用D-Code system (BioRad Laboratories, Hercules, CA) 恒温电泳14 h后，溴化乙锭 (1 μg/mL)染色20 min，用Gel Doc 2000凝胶成像系统观察电泳结果并照相.

1.2.5 分析方法

混合液悬浮固体浓度(MLSS)、混合液挥发性悬浮固体浓度(VSS)、污泥体积指数(SVI)、氨氮(NH3-N)、耗氧速率(OUR)均采用标准方法[17]测定，TOC用总有机碳分析仪(vario TOC CUBE，德国Elementar)测定，ζ电位及粒径分布采用Zeta电位分析仪(Nano-ZS， 英国马尔文仪器公司)测定 .

2 结果与分析

2.1 C60水悬液的制备与表征

C60具有强疏水性而难溶于水，采用四氢呋喃法制备出的富勒烯水悬液形成稳定的富勒烯聚集体 (nC60)，即“亲水性”胶体[18,19].C60水悬液的UV-vis吸收谱如图1，富勒烯聚集体的UV-vis吸收特征不同于C60分子在溶剂中的吸收光谱.图2中制备的C60水悬液的粒径主要在100 nm 左右.UV-vis吸收光谱显示nC60的特征吸收峰分别是218、274、343 nm，与C60在正己烷中形成的溶液相比，特征吸收峰变宽，而且在400～500 nm处出现了新的吸收峰，这是由于C60分子结构中的离域共轭π键具有高电子亲和力，是强电子受体，水中的氧作为电子供体可与nC60形成电子供体-受体复合物[20]，进而在nC60表面形成水化壳，结果导致吸收光谱的变化.经测定，制备得到的C60水悬液的ζ电位为-31.64±1.35 mV.根据理论计算，分散到水中的nC60表面的负电荷来源于水中氧原子与nC60之间的电荷转移作用[21].C60聚集体所带的负电荷量因制备方法不同而不同，nC60颗粒表面的负电荷从-13.5～-50 mV不等[22].正是由于颗粒表面的负电荷,使得颗粒之间相互排斥，从而形成稳定的水溶胶性质的纳米富勒烯聚集体，均与文献[9]一致，说明制备的是纳米富勒烯水悬液.

图1 C60水悬液UV-Vis吸收光谱

图2 C60水悬液粒径分布图

2.2 C60对耗氧速率的影响

耗氧速率(OUR)是评价污泥代谢活性的重要指标，可用来评估系统的处理能力.在污泥体系受到毒物冲击时OUR会有所下降，因此，测定污泥中的OUR是评价化合物对于活性污泥中微生物毒性效应的一种重要手段[23].图3为加C60和不加C60的反应器在运行一个周期内的OUR随时间的变化图.可以看出，随着反应器的运行，试验组和对照组反应器中污泥耗氧速率都经历了首先迅速上升，达到最大值后短时间平稳，急速下降，缓慢下降，达到稳定这五步.两组反应器的OUR最大值均为160 mg/L/h左右，急速下降时间段均发生在40 min左右，且OUR值相当.之后的缓慢下降阶段均持续了约一个小时，最后基本稳定在10 mg/L/h.稳定阶段的耗氧速率极低，因为此时反应器中的营养物质已经基本耗尽，标志着体系进入了内源呼吸阶段.从OUR整体的变化趋势和具体数值来看，C60水悬液对好氧活性污泥的耗氧速率没有显著影响.

2.3 C60对氨氮降解的影响

氨氮是废水处理中评价好氧活性污泥处理能力的重要指标.图4中氨氮的初始值均在10 mg/L左右.试验组与对照组反应器中氨氮的含量均经历了线性下降和达到平衡两个阶段.线性部分在90 min时结束，此时氨氮值下降到0.45 mg/L，此后为平衡期，氨氮数值极低并且变化不大，氨氮去除率达95.5%.由图3可知，在反应前90 min，耗氧速率较大，说明此时微生物活性较高，氨氮去除速率较快；此后随着微生物活性的降低，氨氮的去除速率也随之降低，而反应器中的氨氮含量也趋于零.但从整体趋势及数值来看，试验组与对照组在氨氮降解方面并无明显差别.由以上结果推断，C60在活性污泥对氨氮的降解能力方面并未产生显著影响.

图3 反应器中耗氧速率随时间的变化

图4 NH3-N 浓度变化曲线

2.4 C60对总有机碳降解的影响

微生物对碳源的降解可以从另一方面反映微生物活性的大小.由图5可知，反应器内总有机碳(TOC)在反应开始的40 min内经历了一个较快的线性下降的阶段，降解速率达1.85 mg/L/min，之后降解速率大大降低，最终维持在一个较低的水平，试验组与对照组对总有机碳的去除率分别为67.7%和66.7%，两组对总有机碳降解并无显著影响.

图5 反应器中总有机碳浓度变化

结合图3、图4和图5可知，OUR的急速下降时间与TOC的快速降解时间一致，缓慢下降并产生第二个阶跃的时间与氨氮氧化时间相同.耗氧速率首先上升是由于反应刚开始时，微生物由外源基质耗尽转入营养基质后处于活性恢复阶段.微生物活性恢复后OUR急速上升，达到最大值并短暂稳定，在这一阶段TOC降解非常迅速，OUR水平很高，这个阶段的OUR变化主要是由TOC快速降解引起的.当TOC降解速率较低时，即在40 min左右，OUR产生第一个急速下降，此时TOC降解已经达到67%左右，之后OUR变化较为缓慢.在反应进行到90 min时，产生第二次阶跃，这次OUR变化主要是由氨氮氧化引起的.

2.5 C60对微生物种群结构的影响

PCR-DGGE技术将相同长度、不同序列的PCR扩增片段在变形梯度凝胶上分离，从分子水平上快速、准确地表征微生物群落结构和演替规律，目前已广泛应用于土壤[24]、固体废弃物[25]、水体[26]等研究中.本研究分别取接种污泥、反应6 h后试验组与对照组的活性污泥提取DNA，并对提取出的DNA经过PCR扩增以后采用DGGE技术比较分析两种活性污泥中微生物菌群的结构变化.在PCR-DGGE图谱中，每一条带代表某种可能的微生物类群，电泳条带的数目越多，说明生物多样性越丰富；条带亮度越强，其在群落所占数目越多.

图6 活性污泥DGGE图谱比较注：A为接种污泥，B为对照污泥，C为nC60处理污泥.

如图6可知，在SBR反应器中活性污泥样品的DGGE图谱中，条带数目较多，说明污泥微生物的种群十分丰富.但从图谱中条带的位置及数量可以看出，反应前后反应器中微生物的菌群结构没有发生明显变化.每个样品中均有3～4个较亮的条带出现.图中a、b、c、d这些条带所代表的类群均为反应器中的优势种群.然而，C60的加入并没有影响到条带的位置及亮度，即短期内C60对于活性污泥中微生物的种群结构并无明显影响.这可能是由于本研究仅仅考察了C60对活性污泥体系在一个运行周期内的影响，微生物群落结构的改变未能在短期内做出响应.

Nyberg等[27]考察了富勒烯C60对污泥厌氧硝化过程的影响，90天内气体的产生量无显著差异，C60对微生物群落结构无显著影响.Tong等[16]发现土壤微生物群落对C60具有较强的耐受性，微生物功能和结构受其影响甚小.本研究成果与以上结果具有相似性，说明C60在这些复杂自然环境中的生态行为，不能简单地根据其对纯培养微生物或细胞的毒性作用来推测.自然环境中的腐殖质类物质，巨大表面积的活性污泥絮体，及对C60的吸附作用等都会减少其生物有效性.因此对于复杂的环境样品来说，纳米材料的环境效应会受多种因素的影响，需进一步考察高浓度碳纳米材料作用下的长期效应，为纳米材料的开发和利用提供参考.

3 结论

(1)通过监测反应器中活性污泥对有机碳源的降解和氨氮的利用及好氧呼吸速率，发现C60水悬液对SBR反应器中活性污泥的生化特性无显著影响.反应器投加C60水悬液90 min后，NH3-N和TOC的去除率分别是95.5%和66.7%，与未投加C60水悬液反应器的去除率(95.5%和67.7%)无明显差别.

(2)PCR-DGGE分析结果显示，代表优势种群的条带数目、亮度和位置均未发生明显改变，表明C60水悬液的投加没有造成活性污泥中微生物菌群结构的较大变化.活性污泥系统中微生物之间的功能丰余性增加了该群落对环境的适应性，C60水悬液在短期内对污泥微生物种群的功能和结构不会产生显著影响.