植物凝集素检测方法的研究进展

冷 艳，孙宪迅，王 璐，徐 媛，陈禅友

（江汉大学 生命科学学院；湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北 武汉 430056）

0 引言

植物凝集素（Lectin）是植物界中存在的非免疫来源蛋白质，其结构中含有一个或一个以上能够可逆结合到特异单糖或多糖上的非催化结构域［1］。最早发现植物凝集素的是Stillmark等人，他们在1888年从萬麻籽的提取物中发现一种物质，该物质能使动物红细胞发生凝集现象。随后人们又陆续从其他植物中发现了类似的物质，并证明了该物质在自然界中是普遍存在的。正是由于此类物质能使动物红细胞发生凝集，它们也被统称为血细胞凝集素［2-6］。目前已发现的凝集素有1 000多种，且这些凝集素主要存在于植物的种子和组织中。由于植物凝集素具有生物活性，使得其在食品、农业和医药领域受到研究人员的广泛关注。近年来对于植物凝集素检测方法的研究也取得了一定的进展。

1 植物凝集素的分类

由于不同种类和来源的植物凝集素在分子结构、理化性质、生物活性、糖基结合特异性等方面存在明显差异，因此可根据这些不同的特性，将植物凝集素进行具体的分类。如根据植物凝集素特异性结合不同种类的糖基，可分为：N-乙酰氨基半乳糖凝集素、D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-岩藻糖凝集素及唾液酸凝集素；根据植物凝集素分子结构的不同，可分为全凝集素（hololectin）、部分凝集素（merolectin）、嵌合凝集素（chemerolectin）和超凝集素（superlectin）［7-9］。

2 植物凝集素的生物活性

2.1 植物天然的防御蛋白

植物凝集素在植物防御体系中起着非常重要的作用，这主要是由于植物凝集素具有和单糖或多糖发生特异性可逆结合的能力，尤其是对在植物中不常见或根本不存在的寡聚糖具有很高的亲和力［10］。例如，豆科植物凝集素中的几种可以与细菌肽聚糖的组成成分N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸等发生作用，从而起到防治细菌侵害的作用［11］。几丁质结合凝集素可以与真菌细胞壁中的几丁质或无脊椎动物外骨骼中的寡糖结合，从而防治真菌或害虫对植物的侵害。很多单子叶植物中的甘露糖凝集素对动物（包括人）的反转录病毒具有抑制作用（Peumans）。植物凝集素的这一生物学特性在植物的病虫害防治研究领域越来越被研究人员关注。

2.2 植物凝集素的抗营养作用

植物凝集素是一类抗营养因子，具有抗营养作用，主要表现为：①阻碍动物对营养物质的消化吸收，如大豆凝集素可以导致非血红素铁和脂肪的吸收障碍，增加内源氮的排出，从而降低了氮在动物体内的留存率［7，12］；②对动物生长的抑制作用，且该抑制作用随动物种类、年龄和摄入的量等因素而有所不同，例如大豆凝集素对反刍动物的生长影响远小于其对单胃动物的影响［13］；③影响肠道功能，大量植物凝集素可与大鼠的小肠黏膜上皮细胞结合，导致上皮细胞微绒毛萎缩、刷状缘膜紊乱，使得上皮细胞的正常功能和发育能力下降［7］；④影响胰腺的结构和功能，引起胰腺增生［14-16］；⑤刺激黏膜下的肥大细胞脱粒，从而引发过敏反应［17-20］。同时，某些植物凝集素进入动物体内（尤其是儿童和幼龄动物），能产生较强的IgE抗体，会加重机体过敏反应的发生［21］。

3 植物凝集素的检测方法

研究人员一直都在潜心研究植物凝集素的检测方法，目前的相关检测方法根据检测原理的不同可分为三大类。

3.1 红细胞凝集法

植物凝集素具有红细胞凝集作用，即凝集素与红细胞表面的糖结合位点发生作用，使得凝集素分子在红细胞之间形成多重交叉的桥状结构，从而造成红细胞的凝集现象，同时凝集素的凝集活力（效价）与其量的多少呈线性关系。目前利用血凝反应检测植物凝集素活性的方法是应用最为广泛的植物凝集素检测方法［19，22］。

测定凝集素活性的方法有96孔血凝板法、试管法、Liener法等，其中96孔血凝板法被广泛应用，该方法将动物红细胞（兔、猪、羊、人等动物的红细胞）配制成一定浓度的红细胞悬液，再将其加入到经过一定比例稀释后的凝集素溶液中，放置一段时间后，可通过肉眼观察或比色测定植物凝集素的凝血活性［19，23-24］。试管法是将各待测样与细胞悬液混匀，于37℃下培养1.5 h的肉眼观测血凝程度，然后在2 000 r/min下离心，弃去上清液。将装有血凝细胞的试管于恒温干燥箱中，105℃下干燥至恒重，冷却、称重，得干重量，以其多少评价血凝程度的高低［25］。

红细胞凝集作用受到凝集素自身特点的影响，如糖结合位点的数量和分子大小；同时也受到细胞表面特性的影响，如受体部位的可及性或细胞膜的流动性。同时也受到外部环境的影响，如温度、细胞浓度等，此种检测方法可对植物凝集素进行定性或半定量的检测［26］。

科学家们为了进一步提高凝集反应的灵敏度和准确度，进行了多次改进，比如将凝集反应与分光光度法、激光浊度测定法、光散法和粒子计数法等方法相结合。红细胞凝集法所使用的红细胞可以是新鲜的动物血红细胞或者是新鲜的人血红细胞，也可以使用经过修饰后的红细胞，凝集素对于不同来源的血红细胞（如不同血型、不同动物的血红细胞等）表现出不同的凝集效果。在实验过程中，通过对红细胞的修饰，提高红细胞对凝集素的灵敏度，可以较好地解决这个问题。比如，经过一些蛋白酶（如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等）修饰后的红细胞对大豆凝集素的灵敏度显著增强。2006年，刘琳娜通过大豆凝集素与胰酶修饰红细胞的凝集反应实验证实，经过胰蛋白酶处理后，兔红细胞对大豆凝集素的灵敏度提高了4倍，猪红细胞对大豆凝集素的敏感度提高了6～8倍，而且，原本不会发生凝集反应的鸡红细胞在胰酶修饰后可发生凝集现象［27］。红细胞凝集法具有易操作、耗时少等优点，能够在较短的时间内完成对大量样品的检测，在植物凝集素含量的初步测评中起着重要的作用，但是只有具有凝集活性的多价态的凝集素才可以使用该反应进行检测，对于在特殊条件下的单体或者活性功能片段因不能使红细胞发生凝血反应而无法使用该方法检测。

3.2 糖复合物法

利用植物凝集素能特异性结合糖、糖蛋白或糖复合物的特性对植物凝集素进行检测的方法，即糖复合物法。该方法最早是将糖复合物标记上放射性同位素后，与植物凝集素在一定温度下孵育，由于糖复合物与凝集素的多价糖基结合位点发生相互作用，且生成的结合物在高盐浓度下易产生沉淀，而后借助离心或过滤等方法将结合物分离出来。通过检测沉淀中放射性标记的强度，可计算出标记结合物的量以及结合常数，也可利用抑制剂或竞争性底物对沉淀放射性强度的影响程度，计算出抑制剂或竞争性底物的抑制常数或结合常数，再通过对这些抑制剂的抑制常数的比较可确定待测凝集素的专一性或结合活性，从而得出其含量［28］。根据Pusztai等建立的方法，杨丽杰等［29］利用玻璃板为支持体，在1%的琼脂糖凝胶中加入半乳糖，缓冲液为pH 8.6的0.07 mol/L Tris-甘氨酸溶液，成功地对黑龙江几个大豆品种中的凝集素进行了定性和定量分析。

此外，为了克服红细胞种类对凝集效果的影响，研究者提出一种新的方法，该方法是将具有与待测凝集素特异性结合位点的糖复合物，通过共价连接的方式结合聚苯乙烯胶粒表面，以此来替代红细胞，此检测方法的其他步骤与红细胞凝集反应基本相同［30］。这种方法避免了使用新鲜红细胞带来的不便和影响，还提供了测定凝集素糖结合特异性更为简便的方法。

3.3 抗原抗体免疫法

植物凝集素是一种蛋白质，它可以作为抗原诱导特异性抗体的产生。由此可以采用一些免疫学的方法来测定植物凝集素，如采用酶联免疫法（ELISA）、火箭免疫电泳等方法或放射性免疫分析法（RIA）进行定量分析［28，31］。这些免疫学方法都只能检测植物凝集素的免疫学性质，而不能反映植物凝集素的生物学功能活性，即不能准确地反映出凝集素对红细胞的凝集能力及其与肠壁细胞的结合能力和在体内潜在的毒性作用。为了解决这个问题，研究人员建立了功能性凝集素免疫测定技术，该技术可对待测凝集素的生物毒性及其在动物体内发生的生物学作用进行更确切的评价，如活性凝集素免疫分析法（FLIA）（将凝集素与包被在微滴定平板中的小肠刷状缘细胞膜相结合）、刷状缘凝集素凝集分析法（BBLAA）等［32-33］。

目前的植物凝集素免疫学检测方法能够有效地检测出具有免疫活性的植物凝集素，但由于这些方法中所使用的抗体大多为抗凝集素的多克隆抗体。因多克隆抗体制备的特点，其成分较为复杂，使得现有的植物凝集素免疫学检测方法在使用的范围和标准化程度上受到了一定的限制。比如不同动物种类和不同批次制备可能造成多克隆抗体样品成分和效价不同等，这些因素都会影响检测结果的稳定性和重复性。利用细胞融合技术获得的单克隆抗体具有纯度高、特异性好、重复性好等特点，越来越多地被应用到免疫学检测中。近几年，植物凝集素的检测方法中出现了基于单克隆抗体的功能性植物凝集素免疫测定技术的研究。张海全等［34］以兔红细胞膜作为载体，大豆凝集素纯品作为标准样品，植物凝集素的单克隆抗体作为检测抗体，建立了检测大豆凝集素含量的功能性酶联免疫学方法。

4 展望

随着食品、农业和医药对植物资源的开发和利用，分析植物中的抗营养物质——植物凝集素对其资源选育和利用以及食品安全具有重要的现实意义，建立灵敏度更高、重复性更好、操作性更简便的植物凝集素检测方法必将成为今后的发展方向。由于植物凝集素的检测难度高于一般生化物质，因而目前的各种检测方法尚存在检测稳定性不高、灵敏度欠佳、无法实现真正意义上的高通量等问题。今后，国内外的植物凝集素检测方法的研究将向快速、便捷和高通量等方向发展，未来植物凝集素的检测方法必将是多维而全面的。例如，将多种现有的检测方法进行联用，从而达到准确、高效检测的目的。另一方面，植物凝集素检测方法研究中，也将会应用到更多的新技术，未来的发展方向将会集中在基因工程抗体的使用和改造、纳米技术的应用和多通路自动化检测方案的实现等方面的创新和改造，从而获得更加灵敏、高效的检测效果。