中医药对Dll4-Notch信号通路及血管再生影响的研究*

何志军，姚兴璋，李盛华，赵 萍，蒋振兴

甘肃省中医院/甘肃省陇中正骨医院，甘肃 兰州 730050

Notch基因最早在果蝇体内被证实，随后的研究发现Notch在无脊椎动物到脊椎动物的多个物种内均有表达，包括调控细胞命运，调节细胞迁移、分化和增殖［1］。Dll4-Notch是一条进化保守的信号传递途经，由细胞膜上表达的Notch受体、Notch配体及下游信号分子组成。Notch的配体又称作DSL蛋白，目前已在哺乳动物中发现的5种Notch配体分别称为Delta like1(DLL1)、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2。Notch信号转导的启动依赖于相邻细胞间受体与配体的相互作用，这种相互作用激活了Notch受体的2次酶切事件［2］。

1 Dll4-Notch信号通路与血管再生

血管再生是指从原有的血管内皮细胞增殖、游走，形成新的血管网，并在原来存在的血管结构上长出新血管的生物学过程。血管再生在组织损伤修复、缺血性心脑血管疾病及肿瘤的发生、发展中具有重要作用。血管再生过程依赖促血管发生因子和抗血管发生因子调控。正常人体内有多种抗血管发生因子，可抑制血管生成；然而，当组织成长和生存依赖血液持续地供给氧气和营养时，在胚胎发育、女性月经周期、怀孕和伤口修补等过程中，抗血管发生因子减少，促血管发生因子增加，从而诱导血管生成。若血管生成的调控出现问题，可导致各种疾病(包括恶性肿瘤)的发生。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前发现最强的促血管再生的细胞因子，具有促血管内皮细胞增殖和迁移、促血管生成、延长血管内皮细胞寿命、提高血管通透性等生物学作用［3-4］。内皮细胞被划分为两类细胞：顶端细胞(Tip cell)和柄细胞(Stalk cell)。血管再生的过程为：1)在特定位置诱导并选择顶端细胞的形成；2)顶端细胞的丝足沿着促血管生长因子分泌充足的地方迁移；3)柄细胞在血管芽延伸的时候增殖。在哺乳动物细胞中，Notch信号通路在内皮细胞特化为顶端细胞和柄细胞的过程中起到重要调控作用［5］。Notch在柄细胞中的活性很高，而在顶端细胞中呈低水平表达；相反，Dll4在顶端细胞中表达较高。作为血管形成正向调节因子的VEGF，通过诱导VEGFA的表达而启动Dll4/Notch信号作为负反馈调节因素，有效预防过量血管的形成，从而促进了一个分化良好的血管网能够根据环境的需要而及时形成。其具体机制为VEGFA通过与VEGFR2结合刺激并诱导内皮顶端细胞表达Dll4，Dll4与邻近柄细胞内的Notch信号结合，通过下调VEGFR2和VEGFR1上调的表达水平，抑制顶端细胞表型以促进柄细胞特化，使二者之间保持在一个合适的比例以确保血管出芽的精确性［6］。可见，VEGF是Dll4的正向调节因素，而Dll4是VEGF信号的负向调节因素［7］。2006 年，Noguera-Troise等［8］提出了将阻断Dll4-Notch信号作为治疗癌症的新方法，引起了研究者对于Dll4-Notch信号传递系统治疗肿瘤的关注。肿瘤的生长以往被认为与肿瘤微血管密度MVD呈正相关，即血管生成越多、肿瘤进展越快，因此，常规抗肿瘤血管生成的治疗策略主要是阻止促血管生成因子刺激内皮细胞。近年来，VEGF阻断剂方面的研究认为，阻断剂仅能减少肿瘤中“小血管”的数量，对“大血管”无影响。由于“大血管”的形态与功能更完好且管腔较大，能够为肿瘤传递营养和氧气，增加肿瘤血供，从而改善肿瘤内部的低氧环境并减少坏死区域。而阻断Notch信号，能破坏“大血管”的形成，加重缺氧程度的同时大幅度上调VEGF的表达水平，能够提高VEGF阻断剂疗效。相比于单药治疗，同时靶向Dll4和VEGF能产生抗肿瘤协同效应。

2 中医药对Notch信号通路影响的研究

目前，中医药在抗肿瘤血管生成领域取得了不少成果，但其机制研究仍主要集中在对肿瘤血管生成过程中主要调控因子(如VEGF等)的影响。中药对Dll4介导的Notch信号通路影响的作用机制研究较少。苗学红等［9］采用补肾疏肝方治疗晚期非小细胞肺癌患者，可缩小病灶，提高机体免疫功能，改善生存质量，其机理为补肾疏肝方诱导A549细胞的凋亡，也可能与抑制Notch1、Delta4、VEGF基因表达有关。刘少琼等［10］探讨了姜黄素抑制大肠癌细胞增殖的分子基础可能是通过Notch信号通路来实现，认为姜黄素可抑制Notch信号通路中Notch受体和Jagged配体蛋白表达、抑制γ-分泌酶、抑制Notch信号下游的靶基因Skp2及影响与其相关的其他通路，最终达到抑制大肠癌增殖与转移的目的。有研究［11］认为，养肺活血方能显著改善肺纤维化大鼠的肺泡炎和肺纤维化程度，有效防治肺纤维化。其作用机制与下调Notch1、NICD1、Notch4、Jagged1、Dll4 的 表 达 有关，提示该方可通过干预Notch信号转导来防治肺纤维化。杨丹丹等［12］研究认为，血塞通能够通过促进MSCs表达、抑制VEGF/Notch信号通路改善大鼠心脏功能、减小病理改变程度，促进心肌损伤修复，具有一定的心肌保护作用。作为抗肿瘤血管生成的新靶点，Notch与VEGF信号通路在肿瘤血管生成过程中各自发挥的重要作用好比于“阴阳”两面，两者之间相互协调，共同调控肿瘤血管生成。虽然中医药对肿瘤血管再生及干预肿瘤增值与转移方面取得了一些进步，但这大多集中在抑制血管生成方面，而通过介导Dll4-Notch信号通路促进血管生成在显微外科方面的应用却未见报道。

3 中医药对血管再生影响的研究

除心脑血管领域注重血管再生问题的研究，显微外科、整形外科同样重视血管再生。为保证术后修复组织的成活率，很多修复手术完成的质量很高，但组织新生或修复愈后结果并不理想，如复合骨皮瓣修复术后，血循环障碍致皮瓣成活质量低或骨瓣不愈合。这些问题的核心在于如何促进组织血管再生。临床中很少有人将传统医学与显微外科领域联系在一起。随着中医药在脑血管、心血管方面研究的不断深入［13-14］，显微外科工作者也将传统医学的优势发挥在显微外科血管再生方面。近年来，单味、复方中药或其有效成分提取物在显微外科术后促进神经、血管、骨骼、肌腱、皮肤等组织修复中的应用研究广泛开展［15］；周昭辉等［16］应用桃红四物汤对大鼠随意皮瓣的干预研究发现，桃红四物汤能明显促进大鼠随意皮瓣的成活，提高皮瓣下新生微血管数量，并促进大鼠VEGF的表达。祛瘀生新是中医学中重要的治法治则，历代医学典籍中对这一领域均有详细论述。但大多集中在理法方药方面的研究，没有直观的理解和解释。随着对理论体系的完善，近年来对本领域的研究由功能性的“祛瘀化瘀活血”逐渐过渡到尝试揭开祛瘀后疾病好转、治愈的内在原因。“血瘀”的概念逐渐深入到创伤骨科及显微外科中。中医外科通过手术祛腐以促进正常组织新生的手段其宝贵经验中重要的一环就是手术本身就是“祛瘀”的手段之一，其手术的作用就是“祛瘀”，而手术的目的在于更深层次的“生新”。由此可见，祛瘀生新与显微外科治疗理念相符合，旨在促进术后组织的新生。相关研究［17-18］通过建立动物血管修复模型，观察基于祛瘀生新治则指导下复元活血汤剂对血管、神经显微外科修复术后各相关组织形态结构、血液生化、相关蛋白或基因表达、生理功能学等各方面指标的影响，从客观疗效方面系统探讨祛瘀与“新生血、脉、物”的深层次概念及关系。

消肿止痛合剂为甘肃省中医院院内制剂。由川芎、桃仁、红花、赤芍、生地、当归、三七、木香、青皮、泽兰等组成。具有活血化瘀、消肿止痛之功。大量的临床应用研究认为，消肿止痛合剂可明显促进创伤后肢体肿胀消退，减轻疼痛、改善静脉瘀血，减轻炎症反应［19-21］。有研究报道，在灌服大鼠鼠尾再植模型中发现，消肿止痛合剂能够使大鼠血清中VEGF含量升高，从而保护血管内皮细胞，利于离断血管的修复［21］。但这些研究仅仅涉及促血管生成的物质，而并未客观观察到血管再生的情况以及基于何种原理来促进血管修复，这仍是今后研究的目标。

因此，能否通过介导Dll4-Notch信号通路促进血管生成，这将是中医药在创伤、显微外科组织修复方面新的研究方向［22-23］，能够进一步丰富中医药理论。