盆栽菊花的茎尖组织培养快繁技术

2018-02-13李晓亮张军云段永华张建康王文智杨光炤钱遵姚张翠萍

江苏农业科学 2018年24期

李晓亮，张军云，张钟，段永华，张建康，王文智，杨光炤，钱遵姚，张翠萍

(玉溪市农业科学院，云南玉溪 653100)

菊花[Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.]为菊科多年生宿根草本植物，是我国的传统名花，也是世界四大切花之一，是一种被广泛栽培的重要花卉[1-3]。菊花目前主要用于园林的绿化和观赏，如制作花束、花环、观赏盆花、秋季花坛、花台、盆花群等，深受人们喜爱[3-4]。菊花传统的繁殖方法主要是扦插和嫁接，但存在很多缺点：需较多母株材料、植株病毒逐代积累加重、品质退化、繁殖速度不快、易受季节变化和外界环境条件的影响、病虫害发生频率高等[5-8]，为解决这些问题，目前最有效的技术措施之一是菊花的茎尖组织培养快繁技术[2，4-6，9]。

我国的菊花组织培养技术研究始于20世纪80年代[10]，截至目前的研究主要集中于菊花的花瓣[11-13]、花蕾[2，14]、叶片[15-16]、茎段[6，17]的组织培养，而有关菊花茎尖组织培养技术的研究报道较少[7，9，18]，且这些报道的研究内容简单，仅主要涉及激素与菊花增殖量、生根量的关系，更是几乎没有涉及种苗综合素质。因此，建立完善的菊花茎尖组织培养快繁技术体系，对菊花脱毒复壮、工厂化快繁育苗、种质资源保存等，进而更好地促进菊花的生产发展，具有重要意义。

为此，以盆栽菊花香草水晶的茎尖为材料，研究HgCl2浓度及其灭菌时间、基础培养基、6-BA等9种主要因素对菊花茎尖组织培养快繁的影响，分析培养基与种苗综合素质的关系并据此筛选出适合的培养基，旨在建立一套完善的且能育出优良综合素质种苗的盆栽菊花茎尖组织培养快繁技术体系，为菊花脱毒复壮、工厂化快繁育苗、种质资源保存等提供重要的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

试验于2017年1—7月在玉溪市农业科学院研和基地的组培室实施。

1.2 试验材料

采用盆栽菊花香草水晶的茎尖作为外植体，于玉溪紫玉花卉产业有限公司的盆栽菊花母本园里采集带茎尖长3～5 cm 的菊花茎段。

1.3 培养条件

培养基以MS或1/2 MS或1/4 MS为基础培养基，均含琼脂(强度为1 200 g/cm2)5.2 g/L、白砂糖30 g/L(增殖试验除外)，附加不同的植物生长调节剂。培养基pH值为 5.4～5.6，并用121 ℃高压蒸汽灭菌25 min。培养室温度为(25±2) ℃，相对湿度为35%～40%，光照度约为2 500 lx，光照时间为12 h/d。

1.4 试验方法

1.4.1 外植体的灭菌剪取茎段的顶芽，用自来水流水冲洗1 min，再用洗洁精的水溶液浸泡2 min，在超净工作台上用70%乙醇浸泡30 s后灭菌外植体，设置8个处理：处理1(0.15% HgCl2灭菌2 min)、处理2(0.15% HgCl2灭菌 3 min)、处理3(0.15% HgCl2灭菌4 min)、处理4(0.15% HgCl2灭菌5 min)、处理5(0.20% HgCl2灭菌2 min)、处理6(0.20% HgCl2灭菌3 min)、处理7(0.20% HgCl2灭菌 4 min)、处理8(0.20% HgCl2灭菌5 min)。每个处理灭菌10个菊花茎尖，重复3次，灭菌后的茎尖用无菌水浸泡2 min，切取茎尖生长点(约1.0 mm)，接种生长点入MS+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.8 mg/L+萘乙酸(NAA)0.01 mg/L中(茎尖生长点数为1个/瓶)培养15 d，记录茎尖的细菌污染和存活，统计茎尖的细菌污染率和死亡率，计算公式：细菌污染率=细菌污染的茎尖个数/接种的茎尖总数×100%；死亡率=死亡的茎尖个数/接种的茎尖总数×100%。

1.4.2 初代培养设置2种处理的培养基：处理1(MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.01 mg/L)、处理2(MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.01 mg/L)。将灭菌后无污染的茎尖生长点接种于2种培养基中初代培养30 d。

1.4.3 增殖培养设计L9(34)正交试验(表1)，每个处理10瓶，每瓶接种5个含双腋芽的无菌茎段，增殖培养35 d后调查各处理的植物形态类型、成株(芽)率、株(丛芽)高、节间距、茎粗、增殖系数。调查方法：当接种的茎段分化长成植株或芽时，则认为该茎段已成株(芽)，将成株(芽)数记录为1；调查增殖系数时，若母瓶内为芽(丛芽)时，将2个单芽等同于1个双腋芽的茎段；当调查株(丛芽)高、节间距、茎粗、增殖系数时，均分别在各自所有样本中随机取样调查10个样本，若样本量不足10个，则以实际样本调查；统计成株(芽)率和增殖系数，计算公式：成株(芽)率=[成株(芽)数/接种茎段数]×100%；增殖系数=新茎段(芽)数/接种茎段数。

1.4.4 生根培养采用正交试验+对比试验+附加试验的方法开展菊花生根试验，其中正交试验为L9(34) 设计，对比试验为正交试验的每个处理均添加0.1%的活性炭(AC)，附加试验为植物组织培养中一些经验性或常用的生根培养基，共24种处理的培养基(表2)，每个处理9瓶，每瓶接种5个无菌茎段，生根培养35 d后调查各处理的成株率、植株的根发生部位、生长势、生根率、株高、茎粗、叶片数、生根数、根长、根粗。调查方法：当接种的茎段分化成植株时，则认为该茎段已成株，将成株数记录为1；当调查株高、茎粗、叶片数、生根数、根长、根粗时，均分别在各自所有样本中随机取样调查10个样本，若样本量不足10个，则以实际样本数调查为准；统计成株率和生根率，计算公式：成株率=[成株数/接种茎段数]×100%；生根率=生根的植株数/成株数×100%。

表1 盆栽菊花香草水晶增殖培养正交试验L9(34)设计

1.5 统计分析

采用Excel 2003和SPSS 16.0处理和分析数据，用SNK检验显著性。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌

处理间的菊花茎尖灭菌效果差异显著(P<0.05)(表3)。同一HgCl2浓度下，增加灭菌时间，茎尖的细菌污染率降低，死亡率增加。综合分析处理间的细菌污染率和死亡率，菊花茎尖最佳的灭菌方法是0.20% HgCl2灭菌4～5 min，此处理下的茎尖细菌污染率较低(P<0.05)，死亡率也不算高(<30%)，灭菌非常彻底。

2.2 初代培养

菊花茎尖生长点接种于培养基(图1-A)上培养，5 d后茎尖的生长点萌动，伸长，基部膨大。培养15 d时，诱导茎尖生长点分化成高约1.0 cm的顶芽，芽体形态正常(图1-B)，培养30 d时，分化成高约2.0 cm、含6～8个单芽组成的丛生芽(包括不定芽)，单芽的芽体形态结构良好、健壮、无玻璃化、无黄化(图1-C)。

菊花茎尖在2种初代培养基中的培养效果无明显差异，均表现为芽体的形态结构良好、生长势健壮(图1)。因此，菊花茎尖的适宜初代培养基为MS+6-BA 0.4～0.8 mg/L+NAA 0.01 mg/L。

2.3 增殖继代培养

菊花茎段接种(图2-A)培养后，处理间菊花茎段的发育和增殖分化差异明显，出现了3种植物形态类型：丛生芽(图2-B～图2C)、植株(图2-D～图2-H)、愈伤组织(图2-I、图2-J)。其中，处理1～7的植物形态(图2-B～图2-H)生长势较好，呈(深)绿色、无玻璃化、无黄化、健壮。

表2 盆栽菊花香草水晶生根培养试验设计

表3 盆栽菊花香草水晶外植体灭菌效果

处理间菊花茎段生长量和增殖量的差异明显(表4)：较低的成株(芽)率是处理7、8、9，分别为48.00%、0、0，其余处理(处理1～处理6)的成株(芽)率变化范围为80.00%～92.00%；处理间的株(丛芽)高范围为1.63～3.40 cm；处理间节间距(范围为0.18～0.31 cm)和茎粗(范围为0.87～0.98 mm)的差异均不显著(P>0.05)；处理1、2的增殖系数(分别为17.95、12.30)均显著大于其他处理(范围为4.90～7.10)(P<0.05)。

表1、图2、表4显示，处理1～处理6(基础培养基为MS或1/2MS、6-BA含量为0.5～2.0 mg/L、NAA含量为0.01～0.10 mg/L、白砂糖含量为20～30 g/L)具有较高的成株(芽)率和增殖系数(4.90～17.95)，其中处理1的增值系数最大，且处理1～处理6均具有较好生长势的植物形态。因此，菊花增殖继代的适宜培养基是MS(或1/2MS)+6-BA 0.5～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L+白砂糖20～30 g/L，最佳培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L+白砂糖20 g/L。

2.4 生根培养

处理间成株率差异明显，变化范围为20.00%～95.56%；处理间的生根率(范围为86.67%～100.00%)差异较小，生根率>90.00%的处理占83.33%，其中处理1、10、24成株率和生根率均>90%；处理间的株高范围为1.58～4.84 cm，茎粗范围为0.75～1.19 mm，叶片数范围为6.70～13.90张，生根数范围为2.50～8.20条，根长范围为1.64～5.94 cm，根粗范围为 0.13～0.46 mm(表5)。说明菊花比较容易生根，但处理间的菊花植株生长量和生根量的差异却较大。

处理间菊花的根发生和植株生长势的差异明显(表6)。菊花主要从基部(无愈伤组织)或(和)基部愈伤组织的部位处生根，植株生长势有较好、一般、较差。根系发生和植株生长势均较好的特征是根从基部(无愈伤组织)发出，植株健壮、深绿、笔直、整齐、无玻璃化、无黄化，如处理10、24(表6、图3)。

综合分析成株率、生根率、根发生和植株生长势等，菊花生根的最佳培养基是处理10(MS+AC 0.1%)、处理24(1/2MS+IBA 0.5mg/L+AC 0.1%)，其生根培养效果较好(图3)。

不同因素及其不同水平对菊花生根培养中的成株率、生根率、株高、茎粗影响差异明显(表2、表7)。当基础培养基为MS或1/2MS、NAA含量为0～0.05 mg/L、IBA含量为0～0.2 mg/L、IAA含量为0～0.1 mg/L时，菊花的成株率、生根率、株高、茎粗总体上均具有较大的水平均值(表2、表7)。

表4 不同处理对盆栽菊花香草水晶增殖培养中茎段生长量和增殖量的影响

因此，菊花适宜生根培养基为MS(或1/2MS)+NAA 0～0.05 mg/L+IBA 0～0.2 mg/L+IAA 0～0.1 mg/L+AC 0.1%，试验筛选出的处理10属于此范围。

3 讨论与结论

在有关菊花茎尖组织培养快繁技术的报道中：茎尖的灭菌方法是0.1% HgCl2(无或添加吐温)灭菌1.5～8.0 min，适宜的初代培养基是MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.1 mg/L(或IAA 1.0 mg/L)，适宜的增殖继代培养基是 MS+6-BA 1.0～5.0 mg/L+NAA 0.01～0.5 mg/L(或IAA 0.8 mg/L)，适宜的生根培养基是1/2MS+NAA 0.1～0.2 mg/L(或IAA 1.0mg/L)[5，7，9，18]。这些报道与本研究主要区别于：(1)正交设计是植物组织培养试验研究中一种重要的、常用的方法[19]，其应用于菊花组织培养试验研究中的报道较少[20-21]，本研究进一步采用正交、对比、附加等试验研究方法，比较系统、全面、科学、准确地揭示出盆栽菊花茎尖组织培养快繁的规律。(2)本研究基于成株(芽)率、株(丛芽)高、节间距、茎粗、增殖系数、植物形态、生根率、叶片数、生根数、根长、根粗、根发生的部位、植株生长势等13个指标构成种苗的综合素质来试验分析培养基与种苗综合素质的关系，据此筛选出能育出优良综合素质菊花种苗的适合或最佳培养基，而已有的报道几乎没有涉及种苗综合素质。(3)本研究确定了HgCl2浓度及其灭菌时间与茎尖灭菌效果的定量关系(表3)，筛选出灭菌效果最佳的灭菌方法，而已有的报道却没有具体的灭菌效果。(4)本研究的初代培养是基于器官发生途经(芽诱导)，而已有的报道大多为愈伤组织发生途经。(5)本研究筛选的增殖继代培养的6-BA(0.5～2.0 mg/L)和NAA(0.01～0.10 mg/L)较已有的报道(分别为1.0～5.0、0.01～0.5 mg/L)偏低，这主要是由本研究基于茎段增殖和种苗综合素质来筛选培养基的，而已有的报道大多是先增殖扩繁愈伤组织，分化出芽后再进行芽的增殖。已有报道中的增殖阶段的基础培养基为MS，本研究提出1/2MS也可以用作增殖阶段的基础培养基。有研究表明，当增殖阶段的基础培养基由MS变为1/2MS时，会影响植物形态的发育分化，如生长势变弱，浅绿或黄化或偏黄等[22-23]，而本研究菊花的植物形态在同类情况下(由MS变为1/2MS)的增殖分化未受到明显影响(表1、图2)，说明菊花比较容易分化，其增殖分化阶段的正常生长发育对营养物质需求量的范围较宽。(6)已有报道中的生根培养基(对应本研究的生根培养试验处理21)虽能使菊花生根和生长，但菊花根系的基部附有中度愈伤组织(表2、表6)，本研究从24个处理中筛选出了生根培养效果更佳的培养基：植株根系基部无愈伤组织，生长健壮、深绿、笔直、整齐、无玻璃化、无黄化(表6、图3)。当生根阶段的基础培养基由MS变为1/2MS、1/4MS时，菊花植株的生长势会随之递减变弱(表2、表6)，这与其他作物生根培养上的同类表现情况相似[22]，说明基础培养基对盆栽菊花的生根培养影响较大。本研究表明活性炭总体可以减少生根培养植株基部的愈伤组织，促进盆栽菊花的生根和生长，如处理23和24(表2、表6)，这与其他作物生根培养上所述的观点[23-24]相一致，说明活性炭是盆栽菊花生根培养基的必需成分。笔者研究提出了盆栽菊花生根适合培养基的选取范围，为其他类型菊花(切花型菊花、造型菊花等)生根培养基的筛选提供重要参考。