蛤蚧肽药理活性及其分子鉴定技术研究

2018-02-12孙佳明

吉林中医药 2018年7期

张宇，林贺，金平，王会，张辉*，孙佳明*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林农业大学，长春 130118）

蛤蚧（gekko gecko linnaeus），又名仙蟾、大壁虎等。属于脊索动物门Vertebrata，爬行纲Reptilia，有鳞目Squamata，守宫科Geckonidae动物蛤蚧Gekko gecko除去内脏的干燥体，主要产于广西、云南、贵州等省区[1]。蛤蚧除了作为传统中药有药用价值外，还具有保健食品功能，功效为补肾益肺、纳气定喘、助阳益精[2]。目前对蛤蚧成分研究主要集中在活性成分如功能蛋白质、性激素样化合物、脂类等。蛤蚧蛋白能够调节肿瘤及化疗药物所造成的免疫功能抑制的作用[3]。目前市场上蛤蚧用量不断扩增，中药来源逐年缩减，伪混品常参在蛤蚧药材中，现已出现蛤蚧伪品多达18种[4]。因此本文总结了从DNA分子水平对传统中药蛤蚧及其伪混品的鉴定研究进展，为蛤蚧的蛋白组分研究以及药材的准确鉴定提供参考。

1　分子水平鉴定

1.1细胞色素C氧化酶I亚基基因（COI）条形码序列 DNA条形码鉴别技术，能够达到在利用不同个体所含不同DNA来鉴别药材的真伪度[5]。张红印[6]构建COI序列对比以及邻接（NJ）树。通过鉴定蛤蚧药材和混伪品壁虎等共11个物种，103份样品，所构建的NJ树中真品单独聚在一支，能够准确与其混伪品区分。壁虎和蛤蚧虽为同科属动物，但二者的性状有很大差别，功效也不相同[7]。包华音等[7]通过应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术鉴别壁虎和蛤蚧，提取水溶性蛋白质，对其进行等体积PAGE，分析电泳图谱。结果壁虎和蛤蚧的蛋白质条带在分布和数量方面存在比较明显的差异。而且黑蛤蚧和红蛤蚧，由于地理分布原因导致两种蛤蚧亲缘性较远，应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术，对其进行鉴别，结果显示遗传变异比较丰富，区域性很明显[8]。

1.2COI序列的扩增在现代研究中利用COI序列鉴定蛤蚧时间稍长，蒋超等[4]建立一种快速PCR鉴别技术，在得到特异性条带基础上加入SYBR Green I染料后，365 nm紫外光照射有强烈绿色荧光，伪混品没有以上两种特征。该操作可快速鉴定，且在30 min内就能完成。更有研究表明以线粒体 Cytb、COI、12S rRNA、16SrRNA 基因序列为基础，顾海丰等[9]创建新方法，根据16条COI序列设计了1对位点特异性引物COISF、COISR，同时从Gen-Bank上下载 30 条序列，设计了Cytb SF、Cytb SR，16SrRNASF、16Sr RNASR，12SrRNASF、12SrRNASR这3对位点特异性引物，结果表明正品条带出现扩增，伪品条带不扩增。

1.3rRNA基因序列张月云等[10]研究蛤蚧的两个类群，黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的种群遗传变异情况。采用了这两个类群的6个个体线粒体的12S rRNA基因片断序列，经过系统学分析后，蛤蚧的2个类群间变异范围是4.81%～6.73%；伪品壁虎与蛤蚧群间变异指数是30.44%～35.69%。经此研究得到，黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的暂且不能作为蛤蚧的两个亚种。

2　蛋白组分

2.1蛤蚧的蛋白质、肽、氨基酸目前，国内外研究中药蛤蚧十分火热，蛤蚧的活性成分主要有3种，醇溶性物质，水溶性物质，脂溶性物质。醇溶性部分包括脯、谷、丙、精、天门冬、丝、赖等18种氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酸含量最高；水溶性部分包括钙、磷等无机元素；脂溶性部分包括磷脂、糖脂等脂类。经提取分离得到的蛋白质、肽和氨基酸类，不仅在疾病治疗以及预防方面有重要作用，而且在保健功能上也有突破。且蛤蚧醇提取物有良好的抗感染、调节脂质代谢、保护肝功能作用明显。在保健方面也有增强免疫，强身健体，延缓衰老等作用。蛤蚧中人体必需氨基酸含量丰富，占总量的30%～45%。龚千锋等[11]对蛤蚧身体各部进行氨基酸含量的分析结果表明：其体部和尾部所含氨基酸的加和量最高，分别为 570.18 mg/g 和 566.04 mg/g；头部所含氨基酸的加和量低于体部、尾部，排第三；爪部所含氨基酸的加和量排第四；眼部所含氨基酸加和量为最低。但组氨酸、色氨酸含量低于各部位均值[12]。蛤蚧尾部氨基酸含量高于躯干部，其中作为机体的第一限制性氨基酸，赖氨酸的含量高138倍[12-13]。另还分离出一种多肽，具有抗感染活性。

2.2蛤蚧肽的药理活性

2.2.1抗感染、调节脂质代谢非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一种以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的病理综合征，当前中药蛤蚧在NAFLD疾病方面研究火热。潘磊等[14]以高脂饲料法复制NAFLD小鼠模型，以灌服复方蛋氨酸胆碱溶液为对照药，蛤蚧组小鼠各亚组分别灌服高中低剂量蛤蚧肽溶液。以8周为观察期，记录各组小鼠干预前后脂代谢、肝功能及炎性因子指标变化差异。各组小鼠MDA水平均同干预前对比无统计学意义；除空白对照组及模型组小鼠各检验指标较干预前无明显变化外，其余组小鼠TG、TC等脂代谢指标，ALT、AST等肝功能指标及IL-6、TNF-α等炎性因子指标均较干预前显著降低，SOD水平则显著提升；低剂量组各指标变化幅度均小于中、高剂量组和阳性对照组小鼠；中、高剂量组和阳性对照组小鼠组间对比无统计学意义。

2.2.2免疫调节哮喘严重威胁人类健康，发病率几十年来一直呈上升趋势。目前普遍认为免疫失调是引发该病的重要原因。蛤蚧能明显延长豚鼠的引喘潜伏期，显著抑制哮喘反应，表明蛤蚧具有良好的平喘作用[15]。班建东等[16]以卵清蛋白致敏方法建立BALB/c小鼠过敏性哮喘模型，给予黑斑蛤蚧粉干预治疗。以肺组织病理变化，百分比以及IgE水平为指标。结果肺组织炎症改变不明显；嗜酸性粒细胞占白细胞总数百分比以及IgE水平显著低于实验对照（P＜0.05）。廖成成等[17]以酶联免疫吸附法检测小鼠血清中IL-4、IL-5、IFN-γ水平为指标，黑斑蛤蚧能下调小鼠血清中的IL-4、IL-5水平（P＜0.05），同时上调 IFN-γ水平（P＜0.05）。作用机制可能是黑斑蛤蚧通过双向调节 Th1 /Th2 失衡，从而抑制哮喘气道炎症。

中药蛤蚧具有抗肿瘤作用，其机制也是众多专家的研究热点。李蕾等[13]提取并分离出不同分子量的蛤蚧蛋白组分，采用MTS法观察到分离出的3种蛤蚧蛋白组分都具有不同程度地抑制HepG-2细胞生长的作用，其中分子量为3～20 kD的蛤蚧蛋白组分抑制作用最强，且具有剂量依赖性。Hoechst 33342 /PI双荧光染色法检测出3～20 kD蛤蚧蛋白作用后坏死细胞和凋亡细胞均增加，RT-PCR法检测出3～20 kD蛤蚧蛋白组分作用后c-myc基因mRNA表达水平稍降低，p53基因mRNA表达水平升高，但两者差异均无统计学意义，Bax基因mRNA表达水平明显增高，差异有统计学意义，Bcl-2基因在蛋白作用前后均无表达。

2.2.3性激素样作用蛤蚧肽具有抗衰老作用。蒋兴伟等[18]研究蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响，使用TUNEL 和 PI、Annexin V / PI 3种方法检测卵巢颗粒细胞凋亡率，结果证实3月龄和6月龄实验组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡均明显少于对照组。说明蛤蚧乙醇提取液[19]能有效抑制大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡，从而改善大鼠卵巢功能，并可能由此延缓大鼠卵巢的衰老。