功能性组织工程气管的研究进展及临床应用现状＊

张文雄，徐建军

(南昌大学第二附属医院胸外科，南昌 330006)

严重气管狭窄、原发气管恶性肿瘤或邻近器官恶性肿瘤的侵犯均需行气管切除重建。当成人气管切除长度超过1/2（婴幼儿气管的1/3）时，端端气管吻合因极大的张力而导致吻合口撕裂等致命并发症[1]。虽然同种异体气管或异种气管可以作为替代物，但伴随移植气管来源困难、终生免疫抑制治疗等缺点，临床上难以推广。目前，组织工程已成为解决这一问题的潜在方法。新的气管构架需要能够被覆纤毛柱状上皮横向刚性但纵向柔韧的管状支撑，同时达到能够自我修复、再血管化以及无免疫排斥等要求。相关研究目前已有较多报道，但这些组织工程气管距离临床实际要求仍有一些差距[2，3]。以下，我们针对构建组织工程气管几个关键因素进行分析。

1 管状支架构建

管状支架的构建对附着细胞的生物学活动有很大的影响。一个好的支架应该有利于细胞粘附、迁移、增殖和分化，同时还能够促进组织再生和重塑，不引起局部炎症反应和免疫排斥反应。因此，支架制作时应采用三维多孔结构，以利于细胞生长、营养输送、代谢物清除以及新生血管再生[4]。为防止气管塌陷，支架结构对机械强度有一定要求，而气管支架的强度很大程度上依赖于材料的选择[5]。合成材料往往具有较好机械强度，但缺乏天然生物材料所特有的生物活性。现近，合成材料和生物材料的结合成为主流，这种结合同时具备了良好的机械强度和生物活性。

管状支架的软骨结构主要由非负重部位软骨组织采集的软骨细胞来制作，如鼻中隔、外耳等部位[6]。Kojima等运用鼻中隔软骨以及气管源性软骨细胞制作组织工程气管，发现他们和自然气管有相似的机械特性[7]。Wu等通过培养制作片状软骨细胞团聚体，并将它们缠绕在硅胶管上植入兔皮下8周促进软骨组织成熟。结果发现，植入后的软骨组织在拆除硅胶管后仍保留管状结构，虽然其机械强度较自然气管明显减低[8]。这提示了利用无支架的软骨细胞制作组织工程气管管状支架的可能性。作为替代，干细胞越来越多被用于软骨组织的制备，其中骨髓间充质干细胞因其来源广、易分离等特点成为运用最多的干细胞来源[9]。Fuchs等比较了软骨细胞和软骨分化的骨髓间充质干细胞，发现两者在体内移植后的糖胺聚糖、Ⅱ型胶原和弹性蛋白的表达水平均无明显差别[10]。Kunisaki等诱导骨髓间充质干细胞分化制作工程气管软骨支架，其轮廓与自然气管细胞外基质框架相似[11]。Dikina等在环状模型中将骨髓间充质干细胞分化形成软骨细胞环，进而通过叠环法培养制作无支架软骨管。这种技术不仅提高了轴向平面的机械强度，同时减少了软骨环与连接支架的缝合过程[12]。

近年，一些学者将注意力转移到具有天然细胞外基质的脱细胞生物组织和器官。这些生物支架材料固有的三维结构和生物特性，有利于细胞的贴附生长和功能恢复[13]。将组织中细胞核和细胞质成分去除，仅保留的骨架成分能明显减少排斥反应的风险而不影响力学性能[14]。Conconi等通过生物酶法洗涤细胞成分获得细胞外基质骨架，支持软骨细胞和气管上皮细胞粘附[15]。Seguin等采用深低温冻存法获得了相似的去细胞效果[16]。Butler等运用酶法去细胞的同时，辅助运用真空环境进行辅助，能达到更好的去细胞效果并缩短制备[17]。Xu等运用微孔化处理去细胞同种异体去细胞气管支架并结合自体软骨细胞植入，所得到的移植气管在体内实验中能达到较原生气管更好的机械强度[18]。Jungebluth等在动物实验中证实，猪气管在17次反复酶法去细胞后基本消除MHCⅠ类和Ⅱ类抗原[19]。这项研究从理论上证实将动物气管用于人气管移植的可行性，这将解决供体气管来源不足的问题，但该技术用于临床仍需大量验证。主动脉因其抗原少、滋养血管少以及不分泌粘液等特点，在一些报道中被用来做气管替代物。Martinod等在羊体内实验中证实了血管作为气管移植物的可行性[20]。Wurtz等运用同种异体主动脉对6名气管涎腺型癌患者进行气管移植，所有移植物均能得到很好的再血管化和部分上皮被覆，术后患者均能很好耐受[21]。

随着3D打印技术的成熟，其在组织工程中的运用受到了重视。较传统方法，运用3D打印制造气管支架更符合个体化的气管形态要求，并可以明显减少制备时间。Bhora等运用聚己内酯制作3D移植气管并在猪体内实验进行验证，术后2周病理检查提示吻合口明显的肉芽组织增生伴部分上皮化[22]。Rehmani等的研究取得类似的结果，5/7的实验动物（猪）生存时间超过3个月同时不影响生长[23]。Gao等同样运用聚己内酯制作网状3D移植气管，并在其上植入软骨细胞，移植后兔最长存活时间达10周，最常见的死亡原因为肉芽组织增生所致的严重气管狭窄[24]。

2 气管再上皮化

移植气管上皮层缺失可导致肉芽组织增生以及痰液潴留，严重的可致致命的气道阻塞[12，25]。虽然受体气管上的纤毛上皮细胞能移行至供体气管上，但这个过程需要数月时间。因此有研究表明，上皮细胞和软骨细胞的种植在气管移植物存活中均不可缺少，缺少其中1种或2种均缺少时常因气道阻塞和感染导致移植失败[26]。以往，组织工程气管上皮层制备主要提取气管、鼻中隔或鼻甲的呼吸上皮，其种植后可进一步分化产生纤毛上皮细胞、杯状细胞以及基底细胞[27]。然而，呼吸道上皮的获取从技术上较困难且数量少，难以满足组织工程气管制备的需求。因此，干细胞在上皮化中的运用日渐受到重视，Batioglu等在兔体内实验中发现，植入脂肪组织来源的组织间充质干细胞能明显降低脱细胞气管移植术后气道狭窄、感染等并发症的发生率及严重程度[28]。Kim等发现，皮肤上皮干细胞植入能很好的分化为气管上皮细胞和软骨细胞，这提示将皮肤上皮干细胞用于气管上皮再生的替代细胞来源的可能性[29]。

上皮细胞与间充质间的相互作用在多种器官的形成过程中起到重要作用。Goto等发现，与皮肤和气管中成纤维细胞共同培养的气管上皮细胞能促进假复层柱状上皮以及纤毛的形成，其中杯状细胞和基底细胞的比率和自然气管相似，这种现象在单独培养气管上皮细胞时是不存在的[30]。Kobayashi等发现牙龈成纤维细胞能促进气管上皮细胞的分化和上皮重建，形成和正常气管相似的假复层纤毛柱状上皮层[31]。这表明，气管上皮细胞层的形成受成纤维细胞分泌的可溶性因子介导。因此，双层细胞种植（气管上皮细胞+成纤维细胞）的概念被提出，在体内模型（羊）中发现该结构能较好的支持上皮细胞层形成且不产生明显的纤维化[32]。除了成纤维细胞外，血管内皮细胞在气管上皮的形成和修复中也发挥了重要的作用。Zani等发现，上皮细胞和内皮细胞均能促进去细胞气管骨架的再上皮化，且两者同时存在时效果最佳。其中上皮细胞限制组织损伤和间质增生，而内皮细胞维持上皮层和血管的稳定[33]。由此，在未来组织工程气管的制备中，除了需要种植软骨细胞和气管上皮细胞外，成纤维细胞和血管内皮细胞也应该得到重视。

3 再血管化

血管化对于移植物的存活非常重要，特别是大而厚的移植物。对于短的移植气管，血管内皮细胞能从固有气管内向生长并及时形成新生血管以维持上皮的存活。然而，长段气管移植时，新生血管较难达到移植气管的中点，因而易致缺血改变。移植气管缺血能诱发较多致命的并发症，如肉芽组织增生、气管狭窄等[12]。Luo等在兔模型中将移植气管植入胸骨舌骨肌内进行血管化预处理。结果显示，进过预处理的移植气管较对照组具有更好的纤毛上皮化生以及软骨结构稳定性[34]。Elizabeth等发现，经过再血管化的移植气管较单纯去细胞气管能明显降低术后气管狭窄的发生[35]。这表明，移植物的早期血管化不仅能维持细胞活性，对移植物结构的稳定性也有很大的影响。

以下介绍几种加速新生血管形成的方法：1.在工程气管制备时，植入血管内皮细胞，不仅能维持上皮层和血管的稳定，也能加速新生血管的再生；2.血管生成因子、重组人促红细胞生成素和血管内皮生长因子等均在研究中证实能加快移植气管新生血管的形成[36，37]；3.在移植前将组织工程气管进行血管化预处理，如将工程气管植入大网膜等富血管的受体组织中进行先期培养[38]；4.在器官移植时同期运用受体富血管组织进行包绕，最常用的组织是带血管的大网膜和肌瓣。这些富含血管的组织能够迅速的使移植气管再血管化以减少组织缺血范围和程度[39]。

4 气管移植的临床运用

气管移植临床已有较多报道，2008年，Macchiarini等报道了第一例组织工程气管移植案例[40]。在去细胞同种异体气管支架上植入上皮细胞和软骨细胞后，置入生物反应器中培养96h。在移植后5年的随访中，患者无明显排斥反应，生活质量显著改善，虽然在吻合口部位存在瘢痕性狭窄，但并不妨碍患者的正常生活[41]。气管功能测试表明，患者已恢复正常的肺功能、咳嗽敏感性和排斥力。

Delaere等报道了另一个同种异体气管移植的成功病例。术前将移植气管置入患者前臂皮下进行预血管化，34d后在气管后壁植入患者口腔黏膜细胞并再上皮化4个月。虽然移植气管并未进行去细胞处理，但术前移植气管的上皮细胞已经消失，患者术后呼吸功能明显改善[42]。相较于前一病例，作者推测，将移植气管进行异位移植后，供体的气管上皮细胞会被受体潜移默化的排斥掉，而软骨骨架因其无血管性而逃脱了免疫监视。

Elliot等报道了第一例儿童（10岁）组织工程气管移植病例[43]。移植气管采用脱细胞的同种异体气管骨架被覆未分化的自体骨髓间充质干细胞以及呼吸上皮细胞补片。气管移植后配合使用重组人促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子和转化生长因子促进血管再生、干细胞软骨分化等。术后1周能发现血管生成证据，15个月后气管纤毛上皮化完成，18个月后移植气管恢复正常的机械强度。在4年的随访中，患者恢复正常的生活。

Jungebluth等报道首例运用纳米复合材料（多面体倍半硅氧烷纳米银微粒+聚氨基甲酸乙酯，POSS-PCU）构建移植气管支架被覆未分化的自体骨髓间充质干细胞用于临床气管移植病例[44]。POSS-PCU具有良好的生物相容性、非生物降解性、温和的免疫原性、高机械强度、易延展性和无毒性，使其适合于组织工程中的应用。相比于同种异体气管支架，纳米复合材料更加容易制备以满足患者的需求。患者术后1周出现细菌和真菌感染，2个月后气管内镜活检提示表皮细胞再生和新生血管的形成，5个月后患者恢复正常呼吸功能。

Fabre等报道了12例运用自体组织构建移植气管的病例，他们采用带血管蒂皮瓣（前臂内侧获取）内衬片状肋软骨环，皮瓣滋养血管与胸廓内动静脉吻合。术后所有患者均出现不同程度肺部感染症状，经保守治疗后均康复出院。肿瘤患者术后5年生存期达64.8%，主要死亡原因为肿瘤复发。这种移植气管的制备免除了术后抗排斥药物的使用并且明显缩短了准备时间，在世界范围内得到了一定的认可和推广[45]。

然而，并不是所有接受移植的患者均恢复了正常的生活，一些患者死于潜在的并发症。Martinod等报道1例移植失败案例，15岁女性患者因严重气管狭窄接受干细胞种植组织工程气管移植，患者3周后死于急性胸内出血所致的气管压迫窒息[46]。Berg等对一位76岁气管狭窄患者进行气管移植，移植气管采用去细胞同种异体气管+自体干细胞植入，患者23d后死于心跳骤停[47]。

5 面临的问题

组织工程气管移植虽有一些成功报道，但作为常规技术在临床上广泛使用仍存在一些问题亟待解决。为了更好的了解工程支架和移植细胞在体内的过程，需要进行更多的前期动物实验，以确保临床应用前的安全性、有效性和可重复性。

组织工程气管面临的最大障碍是血管化太慢不能满足移植气管中活细胞的需求。血管从上下吻合口处穿过术后的移植气管，需要数月的时间才能达到长气管的中点，从而导致气管中部的缺血性坏死。组织坏死导致炎症反应和气管狭窄。虽然上面已经提出并实验了几种促进血管形成的方法，但这些技术并没有达到完全令人满意的结果。

目前，脱细胞的同种异种气管移植似乎是一种理想的支架材料，其基质组成和微观结构和供体气管组织相同。此外，完整的脱细胞能明显降低免疫排斥的风险，并由受体细胞促进支架的内皮化。然而，脱细胞同种异体气管移植的供体数量严重不足限制了其临床应用。此外，还需要更加有效、高效的脱细胞技术以减少处理时间，同时保留所有有利于上皮再生的生物学特性。

另一个关于组织工程气管的问题是移植气管的增长（直径和长度），这对于儿童患者是至关重要的。因为儿童患者的身高随着年龄的增长而增加，移植气管缺乏成长性可能妨碍儿童患者的生长，甚至威胁生命。因此，在儿童患者移植气管的设计中，必须要确保气管的成长性，虽然Hamilton等的研究表明移植气管的两端直径能够增加，但这种增加可能是由机械牵拉引起的[48]。

虽然有许多较好的组织工程气管已经过设计使用，但往往都是针对特定受体定制的。这大大影响气管制造的一致性，而且造成移植物的质量差异很大。如何能够规范的、批量的制备合格的移植气管仍是一个巨大的挑战。此外，移植物的储存、运输还有足够的保质期也是亟待解决的问题。

6 展望

气管置换通常不是救命的手术，但可以极大的改善患者症状和预后。综前所述，组织工程气管因其成本低、可批量制造以及制备时间短等特点是移植气管的重要选择。虽然，有较多气管移植成功的病例报道。但制作一个全功能的组织工程气管仍有很多困难需要解决，尤其在移植物再血管化以及组织功能化方面。其中，血管生成研究的最新进展可能是实现这一目标的关键。相信在将来，具有全功能化的组织工程气管广泛用于临床不再是梦想。