发育新皮质中神经元电活动与细胞凋亡之间的内稳态相互作用

田 武，张 研

(北京大学 生命科学学院 膜生物学国家重点实验室；北京大学 麦戈文脑科研究所， 北京 100871)

1 神经发育性细胞凋亡

细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是一种受到非常特定的细胞内信号通路严格控制的有组织的细胞死亡。凋亡的细胞很容易通过典型的形态特征所辨认出来，如: 染色质凝集、细胞皱缩、细胞质膜出泡，最终形成凋亡小体及其很快被周围细胞所吞噬。

细胞凋亡发生在所有物种的所有组织的生命周期中，是细胞增殖自我平衡的一部分。细胞凋亡可以消除异常的、衰老的、非功能的、错误的或潜在的有害细胞。在发育过程中，细胞凋亡可以使细胞在有限的发育阶段完成短暂的功能，同时也可以消除曾经发挥作用但在进化过程中将被淘汰的身体部分，比如在发育中的脊椎动物四肢中，趾间细胞消失，从而产生自由的足趾。细胞凋亡在胚胎期和出生后的早期阶段也广泛地影响着神经系统。小鼠的大脑新皮质中，在胚胎(E)14日爆发的第一次细胞凋亡高潮主要影响神经元前体细胞，第二次细胞凋亡高潮发生在出生后发育阶段的早期，主要影响早期的有丝分裂后神经元。

通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法(TUNEL)或原位末端标记法(ISEL)来标记碎片化的核DNA，我们确定在出生后第一周，大鼠大脑皮质中凋亡神经元的数量为4～12个/mm2，小鼠中则是7个/mm2，而在成年阶段检测不到正在凋亡的神经元。DNA链断裂表明神经元已经处在细胞凋亡过程的后期阶段，标记激活的凋亡蛋白酶- 3则使我们可以检测到刚开始开始细胞死亡程序的细胞。凋亡后细胞在2.5 h内会被吞噬细胞清除。从P5到P20，中间神经元的数量减少了40%[1]，而从P1到P5，海马体失去了大约一半的神经元。鉴于促凋亡或抗凋亡因子的整体敲除会导致神经和非神经组织的异常生理性细胞死亡，并进一步导致胚胎早期致死，我们通常使用条件性敲除来了解早期神经元细胞凋亡的作用。过表达抗凋亡因子Bcl- 2则能抑制神经元细胞凋亡，导致神经系统过度增生。相反，在中枢神经系统(CNS)的神经元中，条件性敲除抗凋亡因子Bcl-xl会导致小脑症和神经行为障碍，如过度活跃、学习和记忆缺陷[2]。因此，细胞凋亡可以维持神经元数量，并最终确保神经系统的结构及功能发育正常。

细胞凋亡在神经系统的形成中发挥重要作用，因此细胞凋亡受到各种因素的严格调控。在外周神经系统(PNS)中，发育中的神经细胞会竞争它们的靶组织释放的有限量的神经营养蛋白——神经生长因子(NGF)。移除靶组织会增加支配性神经元凋亡的比例[3]，而增加靶细胞数量则会减少死亡的神经元数量。因此，细胞凋亡的作用是使神经元的数量与预期靶组织的大小相匹配。虽然敲除单个神经营养因子或其相应的受体都会导致PNS中神经元的大量消失，但它并不能在CNS中引起显著的促细胞凋亡反应。这些发现产生了一种假说，认为两个不同的过程分别控制了PNS和CNS的细胞凋亡。事实上，发育中的CNS神经元似乎更多地依赖于电活动和突触输入，而不是生长因子[4]。细胞死亡区别地作用于不同的神经元亚细胞群，这表明它不仅能确保新皮质神经元的最终数量，还能进一步调节大脑皮质的细胞构成。因此，细胞凋亡是发育过程的重要组成部分，它塑造了神经系统的结构和功能。

2 细胞凋亡调节的途径及机制

细胞凋亡可以由所谓的外部途径来启动：胞外蛋白激活细胞表面受体来招募起始性凋亡蛋白酶，形成死亡诱导信号复合物(DISC)。DISC激活凋亡蛋白酶级联反应并导致细胞的瓦解。在细胞内信号中，发育中的神经元也可以选择性地通过胞内信号启动细胞凋亡，这被称为固有途径或线粒体途径。在凋亡刺激后，细胞色素c从线粒体的膜间隙释放到细胞质中，并与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)和dATP形成凋亡体。这个复合物促进凋亡蛋白酶原- 9剪切并活化成为凋亡蛋白酶- 9。激活的凋亡蛋白酶- 9反过来将凋亡蛋白酶原- 3剪切为活化凋蛋白酶- 3(aCasp3)。这一激活作用标志着细胞凋亡已不可逆，而且aCasp3常被用作细胞凋亡的特定标记。凋亡蛋白依赖型的剪切要么激活靶蛋白(如DNA酶、蛋白酶、转录因子p53)，要么抑制靶蛋白(如核蛋白)，并最终导致不可逆转的细胞瓦解。aCasp3还能进一步剪切其他凋亡蛋白酶，从而导致凋亡蛋白酶级联的放大。

在细胞色素c水平上，细胞凋亡是由Bcl- 2家族成员调节。这个家族的蛋白质由两个对立的亚家族组成。抗凋亡的亚家族Bcl- 2/Bcl-xl通过维持线粒体的完整性来阻止细胞色素c进入细胞质。相反，促凋亡的Bax/Bad 和Bid/Bim亚族的成员可以增加线粒体膜的渗透性，也可以与Bcl- 2/Bcl-xl亚族的成员结合，抑制它们的抗凋亡能力。因此，细胞凋亡可以通过调节抗凋亡和促凋亡因子之间的比例来进行自我调节。

许多外部的促生存刺激可以在细胞存活中起决定性作用。在这些刺激中，生长因子和胞内Ca2+水平升高被认为在神经发育性细胞凋亡中扮演着重要的角色。这些刺激触发了三种主要的促生存信号传导途径：PI3K(磷酸肌醇3-激酶)/Akt通路、PKC(蛋白激酶C)/ERK(胞外信号调节激酶)通路和Ca2+/钙调蛋白通路。简单来说，在促生存信号的作用下，蛋白激酶PI3K激活了丝氨酸/苏氨酸激酶Akt。在细胞质中，Akt可以直接磷酸化并失活Bcl- 2家族的促细胞凋亡成员、凋亡蛋白酶或Forkhead转录因子，从而抑制细胞死亡。Akt可以进一步转移到细胞核中，并将p53磷酸化，从而抑制细胞死亡相关基因的转录，并激活转录因子NF-κB和CREB(cAMP反应原件结合蛋白)，以增加促生存基因的转录。Ca2+瞬变激活了丝氨酸/苏氨酸激酶PKC通路或Ca2+/钙调蛋白通路，从而刺激促生存相关基因的转录。越来越多的证据表明Ca2+直接将信号从突触传递到细胞核。通过这种Ca2+或生长因子依赖性的细胞凋亡抑制作用，在发育中的大脑皮质中观察到的典型自发性活动模式可能为神经元提供了主要的促生存信号。

3 发育性细胞凋亡由不间断活动调节

许多研究证明电活动可以直接影响神经元的生存[5]。在体外培养了7天左右的啮齿动物皮质中，使用TTX沉默神经网络会显著增加凋亡神经元的数量。这一发现可以在体内实验中重复，在P2大鼠脑中注射TTX也能增加皮质神经元凋亡的数量。相反，通过提高胞外K+浓度来增强自发的神经网络冲动，则会减少凋亡神经元数量，这在取自E17～E18大鼠的皮质和取自P0～P1小鼠的皮质中均有发现。使用AMPA/kainate、NMDA或GABAA受体的拮抗剂会在体外实验中减弱或抑制发育中新皮质神经元活性，并在体外及体内实验中提高凋亡神经元的比例。在培养的新生鼠海马神经元中，同步监测电活动和细胞凋亡的结果显示，不活跃的神经元死亡的可能性比集成到同步兴奋网络的神经元要高10倍，因此这也证明，集成到一个同步网络对未成熟神经元是至关重要的。与此发现相一致的是，在神经元聚集并形成最初的突触后，使用Munc18- 1来破坏突触前神经递质会导致强烈的细胞凋亡反应。有趣的是，通过敲除SNAP- 25基因来阻止诱发性递质释放并不会导致E19小鼠大脑中大范围的细胞凋亡反应，这表明自发递质释放可能直到出生前都为神经元提供了足够的促生存信号。由于纯合子小鼠在出生后无法存活，因此在出生早期阶段无法对细胞凋亡进行研究[6]。条件性敲除SNAP- 25的小鼠可能是一个有意义的模型，它可以帮助我们更好地理解动作电位刺激与自发的突触活动对于神经元存活调节的意义。

总的来说，实验数据表明，突触驱动的同步兴奋模式和自然发生的细胞死亡不仅在时间上有重叠[7]，而且在很大程度上可以影响细胞凋亡通路。然而，我们还需要更详细的研究来确证这一观点。不成熟活动模式的空间轮廓和细胞凋亡的区域分布在不同区域和不同层的发育中大脑皮质之间是不均匀的。因此，在这两个过程之间建立一个因果联系将有助于理解每种早期活动模式在发育中功能性环路的细化过程中所发挥的作用。

4 与临床的关联

一系列的体内实验结果表明，抑制神经传递依赖性自发活动会在神经元发育的早期阶段导致神经元的丧失，这为神经元活动水平和细胞凋亡率提供直接的联系。乙醇通过阻断NMDA受体和增强GABAA受体来抑制神经活动。在P4- 7大鼠中，乙醇会在新皮质中引发强烈的细胞凋亡反应[8- 9]。啮齿动物的出生后早期阶段与人类的胚胎晚期阶段相似，与动物实验中的观察结果一致，怀孕母亲对乙醇的吸收会导致所谓的胎儿乙醇谱系障碍。这种综合征表现包括大脑畸形，比如脑容量减少[10]。

绝大多数的麻醉药是作为NMDA拮抗剂、GABA类似物或间隙连接阻断剂来抑制神经活动的。暴露于常见的混合麻醉剂后，啮齿动物的P7新皮质中会发生广泛的神经退行性病变，这也表明了细胞凋亡率的增加。与之类似，一些与GABAA和谷氨酸受体相互作用的抗惊厥剂会加重P8大鼠脑中的细胞凋亡反应。在人类中，胎儿如果与这些药物接触，会引发永久性的结构、行为和认知缺陷，包括大脑质量减少、学习和记忆障碍、焦虑、社会交往和感觉运动障碍[10- 11]。总之，这些观察强有力地证明，在体内神经元发育过程中，其活动水平的降低会使细胞存活与细胞死亡之间的平衡发生变化[12]，从而导致神经系统永久的改变，而且某些细胞凋亡水平增高的特定发育阶段 (啮齿动物的出生后4～8 d，人类的胎儿发育晚期阶段)对这种改变特别敏感。由此，我们很容易推测，病理性增强活动水平很有可能会减少凋亡神经元数量[13]，最终会增加神经元的数量，而且还会导致永久性大脑结构损伤和神经行为障碍。已经证明过度增殖的大脑皮质神经元会导致小鼠类自闭症失常[14]，而自闭症患者的大脑经常会有过多的神经元[15]。因此，我们需要进一步的实验来阐明，在活动依赖性的细胞凋亡的关键阶段，何种程度的不利条件和药物会影响神经细胞的生存，从而产生永久性神经行为缺陷的病因。

5 结论

大量的研究已经证明了神经元活动对中枢神经系统发育的重要影响，例如影响神经发生或神经迁移[16- 18]。在大脑成熟过程中，细胞凋亡的严格调控是另一个重要的过程，神经元活动可以通过此过程细化不同功能的神经元网络。细胞凋亡主要发生在出生后早期的发育阶段，此时自发的神经递质依赖型活动在新皮质活动中占据主导地位。电活动通过特定的途径来调节凋亡过程(Ca2+瞬变、神经营养因子供养)，并且依赖于电活动的同步性，以及神经营养因子受体表达和细胞内信号。为了充分理解电活动对神经元细胞凋亡的作用，仍有以下几个问题亟待解决。同步化活动提供足够的生存效应所依赖的准确的暂时性需求是什么?不同的电活动模式是否以其区域特异性为功能独特的不同神经回路的发育提供信号?活性依赖性凋亡是否会按不同的细胞类型来影响不同的皮质神经元亚型，从而帮助维持生理上兴奋与抑制的平衡?更深入地了解早期活动模式在细胞凋亡过程中如何发挥作用，将有助于我们更好地理解长期性神经缺陷的病因。

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