法尼醇X受体表达与胰腺癌患者预后及病理分期相关

王维斌， 董良博， 赵邦博， 卢 军， 赵玉沛

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 基本外科， 北京 100730)

胰腺癌发病隐匿，进展迅速，早期诊断困难，目前仍然排在全世界癌相关死亡的第4位[1]。胰腺癌手术切除率为9%～36%，接受手术治疗患者的5年生存率也只有19%～24%[2]。胆汁酸(bile acids, BAs)的主要生物学功能是在体内乳化并溶解脂肪聚合物，是胆固醇在体内的主要代谢途径。法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)是BSA的关键核受体，调节BAs、脂类和糖代谢平衡，参与胆汁淤积、非酒精性脂肪肝、肝细胞再生、小肠细菌屏障生长和炎性肠病等疾病的发病机制[3- 4]。

近年来，诸多研究表明FXR与肝腺癌、肝胆管细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、胆管癌的发生机制、化疗敏感性和预后均有密切关系[5- 7]。但FXR在胰腺癌方面的相关研究较少。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人胰腺癌细胞系AsPC- 1、BxPC- 3、Capan- 1、Colo- 357、MIA PaCa- 2、Panc- 1、SU86.86和T3M4由本实验室保存。收集2005年1月至2010年12月在北京协和医院就诊，并最终诊断为胰腺癌患者组织标本共50例和正常胰腺组织标本5名(全部患者均签署知情同意书，本实验获得北京协和医院伦理委员会批准)。胰腺癌患者年龄为45～78岁，平均57.5岁，其中男性26例、女性24例。

Real-time PCR试剂盒(Trizol Reagent)、TaqMan探针、RPMI 1640和 trypsin-EDTA(Invitrogen公司)； KAPA PROBE FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems公司)；兔抗人FXR多克隆和鼠抗人GAPDH单克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和real-time PCR： 应用Trizol reagent试剂盒，按照说明书抽提处于对数增殖期的8种胰腺癌细胞的总RNA，测定RNA浓度，然后反转录合成cDNA，应用Bio-Rad CFX96 real-time PCR系统进行实时定量PCR，循环扩增条件：95 ℃、10 min变性，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40个循环。FXR引物：上游引物5′-AGAAACAGTGTCCGTAGAGC-3′，下游引物5′-GCAG ACCACACACAGCTCAT-3′。

1.2.2 Western blot：大量收集6孔板中处于对数增殖期的8种胰腺癌细胞，应用细胞裂解液提取细胞总蛋白。加兔抗人FXR多克隆抗体在4 ℃冰箱内孵育过夜,羊抗兔IgG抗体在室温下孵育1 h，兔抗人FXR多克隆抗体按照1∶500稀释应用，鼠抗人GAPDH单克隆抗体按1∶5 000稀释应用。

1.2.3 免疫组化染色及评分系统：兔抗人FXR多克隆抗体按照1∶200进行稀释应用，免疫组化具体实验步骤如前所述[8]。邀请两位病理科医生独立分别针对FXR染色的强度及范围进行评分。染色强度评分情况如下，无染色：0分；弱：1分； 中度：2分；高度：3分。染色范围评分情况如下，<5%：0分；5%～25%：1分；>25%～50%：2分；≥50%～75%：3分；>75%：4分。然后，取两者的乘积得到最终总评分，并按照分数高低将样本分为FXR低度表达组 (<4分)和FXR高度表达组 (≥4分)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 FXR在胰腺癌8种细胞中的mRNA和蛋白表达水平

FXR蛋白在胰腺癌细胞中普遍表达，其中在Canpan- 1和T3M4中高度表达，而在MiaPaCa- 2和Panc- 1细胞中相对表达较低，与real-time PCR结果相似(图1)。

A.Western blot results showed that FXR protein was highly expressed in pancreatic cancer cells Canpan- 1 and T3M4, while in MiaPaCa- 2 and Panc- 1 cells, FXR was lowly expressed; B.real-time PCR results showed that FXR mRNA was also highly expressed in pancreatic cancer cells Canpan- 1 and T3M4, and was lowly expressed in MiaPaCa- 2 and Panc- 1 cells, accordant with Western blot results;*P<0.05,**P<0.01 compared with Aspc1 mRNA expression

图1应用Westernblot和real-timePCR方法检测FXR在8株胰腺癌细胞中的蛋白及mRNA表达水平

2.2 检测FXR在正常胰腺组织和胰腺癌组织中的蛋白表达水平

FXR在正常胰腺组织中普遍表达水平较低(图2A)，而在胰腺癌细胞中呈不同程度的胞质和细胞核高表达(图2B～D)。FXR在胰腺胰岛细胞中亦呈普遍高表达(图2E)，FXR在胰腺神经组织内表达阴性(图2F)。

2.3 FXR蛋白表达水平与胰腺癌患者的病理G分期及生存时间密切相关

FXR的蛋白表达水平与患者病理G分期密切相关(P<0.05)，即病理分化差的G3期胰腺癌组织中，FXR蛋白表达水平相对较低。FXR蛋白表达水平与病理G分期均为胰腺癌患者预后的独立因素(P<0.05)。胰腺癌FXR高表达患者的生存时间明显长于FXR低表达患者(P<0.05)(图3和表1)。

3 讨论

FXR是配体激活的转录因子，属于核受体超家族成员之一，在体内主要负责胆汁酸的代谢平衡稳定，本文重点讨论FXR在肿瘤发生、发展机制方面的生物学功能。FXR可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且促进肿瘤细胞向正常细胞转化，FXR通过下调EGFR磷酸化和ERK活性来抑制小肠上皮细胞增殖和肿瘤的发生[9]。应用法尼醇直接刺激胰腺癌BxPC3细胞，可以显著诱导胰腺癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，同时伴随凋亡相关Bak基因表达上调[10]。FXR的表达水平与胰腺癌细胞的侵袭性呈负相关，即对肿瘤细胞发挥抑制作用[11]。FXR在结肠癌组织中低度表达，而在癌旁组织中的表达水平相对较高，与结肠癌患者的生存时间呈正相关[12]。

A.localization of FXR in plasmalemma and cell nucleus of normal pancreatic duct cells showed negative staining; B.weak expression of FXR in pancreatic cancer cells; C.moderate expression of FXR in pancreatic cancer cells; D.strong experssion of FXR in pancreatic cancer cells; E.moderate expression of FXR in pancreatic islet cells; F.no staining in pancreatic nerves; immunohistochemistry was performed with FXR(1∶200)

图2免疫组化方法检测FXR在正常胰腺组织和胰腺癌组织中的定位与蛋白表达

Fig2FXRlocationandexpressioninnormalpancreatictissuesandpancreaticcancertissueswithIHCs(×50)

A.survival time of pancreatic cancer patients with high FXR expression was obviousely longer than those patients survival time with low FXR expression, FXR expression was closely positive related with survival time of pancreatic cancer patients(P<0.05); B.survival time of pancreatic cancer patients with pathological grade G1/G2 was apparently longer than those patients with pathological grade G3(P<0.05)

图3Kaplan-Meier和log-rank方法对预后因素应用COX比例风险回归模型进行多因素分析

Fig3Kaplan-Meierandlog-rankanalysesofprognosticfactorsassessedinamultivariableanalysisusingaCoxproportionalhazardsmodel

FXR表达上调可以明显抑制肝癌细胞在裸鼠体内的增殖速度[13]。本实验结果与报道完全一致，FXR的表达水平与胰腺癌病理G分期密切相关，而且与胰腺癌患者的生存时间呈显著性正相关，是胰腺癌患者的独立预后因素。

亦有研究报道在其他肿瘤中，FXR却发挥着相反的生物学功能，FXR在乳腺癌细胞及组织中高表达，可以促进乳腺癌淋巴结转移及通过与雌激素受体(estrogen receptor, ER)的相互作用促进肿瘤细胞增殖[14]； FXR在食管癌细胞中高度表达，并且与肿瘤的病理分化程度差、肿瘤体积大和淋巴结转移呈显著性正相关[15]。

表1 FXR表达水平与患者临床资料的相关性分析

*P<0.05 compared with normal pancreatic tissue.

综上，诸多研究证明FXR确实在不同类型肿瘤的发生、发展机制中均发挥着不同的生物学功能，其作用机制尚不清楚。而且，胆汁酸在体内代谢除了熟知的核受体FXR，还有膜受体TGF5(G protein-coupled receptor，TGR5)，同样发挥着纷繁复杂的生物学功能，需要进一步地深入研究和探索。

参考文献：

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