牙髓干细胞增殖、分化和迁移的研究进展

刘定坤, 杨 楠，金巨楼，孙梦洁，王 倩，吴 佳，刘志辉

(吉林大学口腔医院修复科，吉林 长春130021)

自2003年施松涛教授提取并分离出牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)之后，其作为一种可再生性间充质干细胞在组织再生研究领域引起学者的广泛关注。临床上，DPSCs易从阻生齿、多生牙以及正畸牙中的牙髓组织中提取。DPSCs在体外环境中易于培养，其传代增殖后依然保存着良好的干细胞特性。对于轻、中度的牙齿损伤，DPSCs可迁移至损伤处，分化为成牙本质细胞参与反应性牙本质的形成。目前，国内成功开展了国际上首个全长牙髓再生的临床研究，进一步证明了DPSCs可作为种子细胞用于组织工程的可行性。本文对DPSCs的增殖、迁移以及分化的研究进展做一综述，以期为DPSCs在转化医学及临床应用方面的研究提供新的思路和策略。

1 DPSCs的生物学特征

牙髓是牙体组织的一部分，含有结缔组织、间充质细胞、神经纤维、血管和淋巴等。Gronthos 等[1]收集了19～29 岁患者的第三磨牙，取出牙髓组织，用酶消化法得到单细胞悬液进行培养后发现：细胞可以自我增殖，其免疫表型与骨髓间充质干细胞(bone marrowstromal stem cells，BMSCs) 相似，在体外一定条件下可形成矿化结节；将细胞植于免疫缺陷的小鼠体内，有牙本质样组织形成，证明其可分化为类成牙本质细胞。且该细胞又具有高度增殖和克隆能力，因此将其命名为DPSCs，证实了牙髓组织中干细胞的存在。

2DPSCs的增殖

随着近些年科学技术的提高，诸多学者不断尝试新的培养方式，如改变物理环境、化学药物刺激和支架共培养等，用于研究DPSCs的增殖以及如何加快DPSCs的增殖速度。

2.1 物理效应 在三维动态模拟微重力、3D多孔培养、静磁场和缺氧环境下培养等各种区别于正常的培养环境下，DPSCs的增殖速度均高于对照组。①三维动态模拟微重力。Li 等[2]探讨三维动态模拟微重力环境中，人牙骨髓干细胞(hDPSCs)在裸鼠体内乳酸-乙醇酸[poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]支架下的增殖及成牙本质分化的能力，组织学检查及免疫组织化学检测结果显示：实验组中Ki-67、Ⅰ型胶原、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质基质蛋白Ⅰ(dentin matrix protein-Ⅰ，DMPⅠ)表达均高于对照三维静态培养组，表明在体内三维动态模拟微重力环境条件下培养，可提高hDPSCs的增殖及成牙本质分化能力。②3D多孔培养。Bhuptani 等[3]发现：多孔微支架可以为干细胞的生长创造一个3D微环境，在体内或体外控制其生长。该实验使用互相关联的多孔PLGA微支架促使DPSCs在体外增殖，观测其生态学特征以及黏附性，并通过MTT和RT-PCR法检测其增殖能力，结果表明：实验组hDPSCs在平均增长数高于2D对照条件培养；此外，细胞活性和基因表达结果证实：实验组hDPSCs的可塑性高于对照组hDPSCs可塑性，提示新型多孔微小支架作为三维培养基使组织干细胞工程更有前途。③静磁场：Lew 等[4]通过在0.4 t静磁场下hDPSCs和对照组分别培养发现：0.4 t磁场影响细胞膜和细胞内钙离子的活性，该效应可以激活p38丝裂原活化蛋白酶信号通路，从而重组细胞骨架，促进细胞增殖。④缺氧环境：Kanafi 等[5]发现：来源于脱落乳牙中的DPSCs相较于恒牙中的DPSCs在低氧环境中表现出更强的增殖能力。

2.2 化学药物刺激及支架共培养 在培养环境中添加不同种类的物质如胰岛素样生长因子1(insulin like growth factorⅠ，IGF-1)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)[6]和黄瓜籽正丁醇提取物[7]等，hDPSCs可表现出高于对照组的增殖速度，与支架材料的共培养也可以显示出实验组的增殖速度明显高于对照组。①生物膜。Soares 等[8]将胶原凝胶与壳聚糖溶液(2∶1)混合，再加入活性铝酸钙水泥形成矿物相的生物膜作为实验组，惰性材料聚苯乙烯作为对照组，将hDPSCs接种于2种材料的表面，结果显示：实验组hDPSCs的增殖速度明显高于对照组。②不同支架材料。Khojasteh 等[9]通过评估市场上提供的4种支架材料[SureOss、Cerabone、聚L-乳酸(PLLA)和OSTEON]对hDPSCs的黏附性、增殖及分化的影响，结果发现：除SureOss外，所有生物支架材料均促进hDPSCs黏附、增殖和分化，接种于聚PLLA支架上的细胞表现出的增殖和黏附性最高。

2.3 其他 DPSCs的增殖与机体生长阶段也有关。Ling 等[10]通过观察未成熟比格犬前磨牙不同程度的不可逆牙髓炎，早期DPSCs的增殖及成骨分化潜能强于后期。不同生长因子对DPSCs的增殖、分化和迁移等有着不同的作用。Wen 等[11]通过体外实验比较基质细胞衍生因子 (stromal cell-derived factor-1，SDF-1)与粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)对hDPSCs增殖、迁移及分化的影响，结果显示：与G-CSF比较，SDF-1对hDPSCs的增殖无明显影响，但能明显促进hDPSCs迁移和分化能力。

3 DPSCs的迁移

趋化现象是一种复杂的生物行为，由趋化因子与受体结合而启动，同时伴随着细胞骨架的重排。趋化因子是一组能够诱导细胞迁移的分泌蛋白。

在龋病的最后阶段，炎症将会出现在龋齿下的髓室并诱导成牙本质细胞凋亡，hDPSCs可在一定程度上补救这一过程[12]。hDPSCs属于间充质干细胞，表达一系列趋化因子和附着受体。hDPSCs被表达在细胞外基质的趋化因子所刺激，此后迁移至受损区域，在成牙本质细胞分化和修复性牙质形成中起重要作用。

Li 等[12]发现：SDF-1与其G耦合蛋白受体CXCR4相互作用来诱导SDF-1/CXCR4信号；hDPSCs的迁移被SDF-1以浓度依赖方式所诱导，也可以被CXC趋化因子受体4 小干扰RNA(siCXCR4)、细胞分裂周期42小干扰RNA(siCDC42)和药物抑制剂[如CXCR4拮抗剂(AMD3100)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(LY294002)以及黏着斑激酶(FAK)抑制剂(PF573228)]所抑制；限制SDF-1的活性或阻止其与CXCR4的结合可降低hDPSCs的迁移能力；Western blotting检测结果表明：SDF-1以剂量依赖方式影响CXCR的表达；Transwell实验证明：在下室培养液中随着SDF-1剂量增加，可见大量hDPSCs迁移至下室。SDF-1/CXCR4轴与FAK、PI3K、GSK3β和β-catenin通路相互作用一同调控hDPSCs迁移。

Wen 等[11]也发现：SDF-1对hDPSCs的增殖无明显影响，但对迁移及成牙本质分化的影响较G-CSF明显。Yang 等[13]通过体外研究表明：SDF-1可以明显提高hDPSCs的迁移，自噬抑制剂明显抑制hDPSCs的迁移，而自噬激活剂大大增强SDF-1α刺激细胞迁移的能力。Zeng 等[14]模拟临床发现：根管冲洗后释放出大量转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)并非bFGF，TGF-β1释放到根管内能够诱导hDPSCs的迁移。

4DPSCs的分化

hDPSCs是牙髓未分化的外胚间充质细胞，在不同诱导剂作用下，可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞和神经样细胞等多种细胞[15-16]。Laino 等[17]从34例17～39岁的患者中取出第三磨牙，分离牙髓组织后成功诱导hDPSCs向成骨细胞分化。Almushayt 等[18]发现:hDPSCs可以向成牙本质细胞诱导分化。Zhang 等[19]利用酶消化法分离人第三磨牙内牙髓来源的间充质干细胞，通过其生物学行为证实其符合hDPSCs特征，且至少能维持其生物学特性在25代左右；分别用神经性、骨性、脂肪性、成纤维性和软骨性诱导介质诱导可定向分化，具有5个方向的分化潜能。

4.1 炎症和年龄对hDPSCs分化的影响 目前临床上对于局限性及可逆性牙髓病变多选择以保存活髓为目的的治疗方法，但对行牙髓切断术后切除的炎症牙髓组织没有采取合理的利用。Li 等[20]通过移植自体来源发炎牙髓组织中的干细胞修复人牙齿周围的骨缺损，实验结果显示：实验组炎症组织来源的牙髓干细胞(DPSCs derived from inflammatory dental pulp tissue，DPSCs-IP)依然保持着成骨、成软骨和成脂肪分化的潜能，相较于非炎症组织来源的牙髓干细胞(DPSCs derived from normal dental pulp tissue，DPSCs-NP)，成骨分化潜能虽然有轻微的下降，但实验组成软骨和成脂肪分化能力无明显变化。尽管DPSCs-IP成骨能力有轻微的降低，但是在临床治疗中，DPSCs-IP仍然是DPSCs-NP良好的替代品。Hozhabri 等[21]也发现：hDPSCs暴露于炎症介质时，NF-κB的低表达可以增强其向成牙本质细胞分化的能力以及胶原蛋白的表达。为探讨不同年龄段人体内hDPSCs自身分化能力是否相同，Yi 等[22]通过检测青年到老年不同年龄段捐献者hDPSCs的分化潜能发现：来自青年捐献者的hDPSCs有着更强的增殖能力以及成骨分化和成脂肪分化能力。hDPSCs的活性受机体自身牙体状态的影响，有炎症的牙髓组织依然具有一定的利用价值。

4.2 成骨/成牙本质分化能力 hDPSCs在机体内对修复受损的牙本质起着重要的作用，因此hDPSCs向成牙本质细胞分化一直是研究的热点。此外，成牙本质细胞与成骨细胞有着相似的生理作用，因此对于hDPSCs向成骨细胞分化用以治疗骨缺损也逐渐引起学者的关注。按照不同的诱导分化方式，大致可分为物理诱导、化学诱导和生物诱导等。(1)物理诱导：①低氧环境。Wu 等[23]观察经过低氧预处理的hDPSCs向成骨细胞分化的能力发现：实验组产生更多的矿化结节；检测成骨基因表达谱发现：实验组hDPSCs mRNA和蛋白表达水平均高于对照组。说明低氧预处理的hDPSCs能够明显增强hDPSCs成骨方向的分化。Werle 等[5]研究表明：在低氧环境下hDPSCs的分化潜能与旁分泌作用增强有关。②氧化石墨烯(graphene oxide，GO)培养基。Rosa 等[24]用GO作为培养基检测hDPSCs的生物相容性、分化潜能和物理及表面特性，实验组培养基支持hDPSCs的黏附和增殖，能够促进其表达某些矿物质基因(MSX-1、PAX-9、RUNX2、COL1、DMP-1以及DSPP)并且表现出良好的生物相容性。该实验表明：在不使用化学诱导剂的情况下，GO可以诱导牙源性基因的高表达，未来可以着眼于特定种系的研究。③正畸负荷治疗。Yu 等[25]对大鼠进行正畸治疗诱导牙齿重建发现：正畸治疗在体内通过活化促炎因子白细胞介素14-A(Interleukin-14A，IL-14A)改变牙髓微环境，明显地促进hDPSCs自我更新以及分化的能力；体外模拟体内的白细胞介素17-A(Interleukin-17A，IL-17A)环境，实验结果与体内实验结果一致；通过油红O染色、茜素红染色以及Western blotting分析：实验组hDPSCs成脂、成骨能力均高于对照组。该研究结果表明：正畸治疗促进hDPSCs 自我复制以及增强多向分化的能力，尤其是在大鼠正畸负荷7 d后结果明显。(2)化学诱导：①辛伐他汀。Jia 等[26]研究辛伐他汀在DPSCs增殖、分化方面的作用以及在活髓切断术后DPSCs诱导髓室再生的作用，结果显示：1 μmol·L-1辛伐他汀抑制犬DPSCs增殖，增加碱性磷酸酶的活性和矿化结节的产生，表明辛伐他汀具有促进犬DPSCs成骨/成牙本质分化的能力。②生物膜。Soares 等[8]将胶原凝胶与壳聚糖溶液(2∶1)混合，加入活性铝酸钙水泥为矿物相的生物膜构成实验组，惰性材料聚苯乙烯构成对照组，将DPSCs接种于2组生物膜表面，检测ALP、总蛋白、DMP-1/DSPP基因表达和矿化结节的沉积，结果显示：生物膜诱导DPSCs分化的成牙本质细胞为高度分泌型。③支架材料。Khojasteh 等[9]评估市场上提供的4种支架材料(SureOss、Cerabone、PLLA 和 OSTEON )对hDPSCs的黏附性、增殖及分化的影响，结果显示：培养14 d后，PLLA和OSTEON支架中的DPSCs与Cerabone支架比较ALP活性明显升高，3种支架中培养的DPSCs成骨活性比较差异均具有统计学意义。④胰岛素。Lauritano 等[27]证实胰岛素可以影响DPSCs的增殖以及向成骨方向的分化，并将进一步探索使用这种新方法进行骨组织重建的研究。(3)生物诱导：糖代谢，特别是线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解，在细胞生命活动中起着重要的作用。糖代谢可以被重新编程来维持干细胞或诱导干细胞的分化，从而调节组织修复和再生。Wang 等[28]通过实验发现：当细胞在诱导矿化的培养基上开始分化时，线粒体嵴变得细长发达，线粒体耗氧率明显增强，表现为基础呼吸增加和线粒体ATP的产生，结果表明糖代谢的重新编程伴随着DPSCs的分化，可能在牙髓修复调控过程中扮演重要的角色。Wen 等[11]在比较SDF-1与G-CSF对DPSCs增殖、迁移和分化的影响时发现：2组DPSCs均有明显地向成牙本质细胞分化的潜能：表现出较高的ALP活性、较多的矿化结节及较多的DMP-1和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)表达。

4.3 其他分化方向的能力 Li 等[29]发现：miR-143和miR-135抑制剂能够诱导hDPSCs分化为骨骼肌细胞；从正常成人第三磨牙分离而来的DPSCs与5-Aza体外培养来诱导其向成肌细胞分化，结果显示：miR-135 和miR-143的表达在被5-Aza诱导的DPSCs形成的成肌细胞中明显减少，部分被miR-143和miR-135抑制剂处理的DPSCs表现出明显的成肌细胞特性，共转染miR-143和miR-135抑制因子的DPSCs成骨骼肌分化并分化后的细胞一半形成肌管。 Kim 等[30]发现：纳米图案化表面可以通过改变hDPSCs的外形与基因表达来增强其向成脂分化的能力，但同时抑制成牙本质分化的能力。Chen 等[31]证明：从冷冻保存牙髓组织中提取的DPSCs不仅有向肝细胞样分化的可行性，而且分化后的细胞具有正常的核型并且功能接近正常肝样细胞。Westin等[32]使用泵(10 mL·min-1)把壳聚糖醋酸溶液加入到pH值为7.7且含有7% poloxamer 188的黄原胶水溶液中，机械搅拌、烘干消毒后制成支架。将无菌支架放置于24孔板中，加入含有100 μmoL·L-1kartogenin的成软骨培养液使之充满支架内部空隙；使用注射器将DPSCs细胞悬液分4个不同区域注入支架内部，确保DPSCs充满整个支架内部孔隙；细胞在孵箱内孵育2 h后分别将2 mL成软骨培养液加入24孔板内防止细胞分离，培养14 d后分化为软骨细胞。

5 问题与展望

自2000年来，国内外学者在DPSCs的形态、生物特性和生物相容性[33-37]等方面进行了详尽的研究，最终取得了显著的成果。Li 等[38]认为：hDPSCs是一种很有前途的自体骨组织工程种子细胞并且目前已有临床应用的案例。DPSCs在骨组织工程学领域已经进入临床研究阶段，但向其他组织分化的研究仍在细胞和动物实验阶段。此外，DPSCs在临床上获取数量有限，用于临床治疗缺乏长期跟踪报道，以上问题制约了DPSCs在临床上应用。未来的研究应着眼于找寻DPSCs更具特异性的标记物，对于DPSCs的培养方法也应施行国际化规范，以便于确定其增殖和分化的程度。