人毛囊间充质干细胞临床应用的研究进展

周 丹,赵 辉,赵 洋,刘晋宇

(1.吉林大学第二医院儿科，吉林 长春 130041；2.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 130021)

毛囊是皮肤附属器之一，起源于胚胎发育时期表皮与间充质间相互作用。人毛囊不断经历生长期、退行期和静止期，周而复始，形成毛囊周期。毛囊周期伴随人类一生，同时毛囊还表达胚胎干细胞标志物sry相关HMG盒转录因子2(sry-related HMG box-containing transfactor2，SOX2)，因此毛囊被认为是成体内胚胎组织之外唯一存在的胚胎样组织。毛囊中含有多种干细胞，包括角朊干细胞、黑色素干细胞、神经脊干细胞和间充质干细胞。这些干细胞在时空上相互作用，共同维持毛囊的自我更新和毛囊周期正常运行。其中毛囊来源的间充质干细胞(hair follicle-derived mesenchymal stem cells, HF-MSCs)是成体干细胞家族成员之一，不仅表达间充质干细胞标志物如CD44、CD73、CD90和CD105，还具有分化为脂肪、骨、软骨、平滑肌和神经等多种组织特异性细胞的潜能[1]。来源于人的HF-MSCs被称为人毛囊间充质干细胞(human hair follicle-derived mesenchymal stem cells, hHF-MSCs)。人毛囊来源丰富、获取方便、获取微创且几乎不受年龄的限制，因此作为自体干细胞来源具有其他成体组织来源的干细胞难以比拟的优势。毛囊干细胞已经在临床上用于脱发的治疗[2]，近年来国内外学者对hHF-MSCs的生物学和再生医学方面在体内及体外均进行了一些研究，并取得了一定的进展，但国外关于hHF-MSCs的综述[3]较少，国内尚未见相关综述。本文对hHF-MSCs的临床应用前景做简要概述。

1 hHF-MSCs作为自体细胞用于制备诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPS)

干细胞的研究者们最早将研究焦点集中于胚胎干细胞。胚胎干细胞是指早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，其具有体外培养无限增殖、自我更新和发育成完整个体的潜能，属于全能干细胞。但利用胚胎干细胞开展再生医学研究存在如下问题：伦理限制、来源有限和致瘤性。为解决胚胎干细胞研究和应用过程中存在的上述问题，日本科学家[4-5]通过核移植技术在小鼠体内导入4种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，成功地将小鼠的体细胞重新编码成为胚胎样干细胞，即IPS。IPS的诞生不但可以解决胚胎干细胞的伦理和来源有限问题，同时也可解决成体干细胞分化能力有限和异体来源存在免疫排斥反应的问题，为药物筛选、毒理学和再生医学研究提供了亚全能的自体干细胞来源，成为干细胞研究史上重要的里程碑。关于IPS的研究于2007—2008年被《Science》、《Cell》和《Nature》等权威杂志评选为年度重大科学进展和最受人们关注的领域之一[6-7]。Muchkaeva等[8]及Wang等[9]分别通过导入Yamanaka应用过的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等4种转录因子，成功地将人毛囊真皮乳头细胞和hHF-MSCs重新编程为IPS细胞。由hHF-MSCs重编程的hHF-IPS具有正常的二倍体核型，表达阶段特异性胚胎表面抗原3(stage-specific embryonic antigens，SSEA-3)、SSEA-4、肿瘤排斥抗原1-60(tumor rejection antigen，Tra-1-60)和Tra-1-81等胚胎干细胞特异性标志物及多潜能转录因子Nanog和Oct4等。hHF-IPS植入非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(non-obese diabetic-severe combined immune deficency，NOD-SCID)小鼠体内，可产生外胚层、中胚层和内胚层组织细胞成分的畸胎瘤。在此基础上，Shi等[10]于2016年通过添加不同细胞因子对hHF-MSCs进行4个阶段培养诱导，具体如下：第1阶段加入激活素A(activin A)，诱导hHF-IPS向内胚层分化；第2阶段加入成纤维细胞生长因子4(FGF-4)和骨形态发生蛋白4(BMP-4)促其向肝细胞特化；第3阶段加入肝细胞生长因子(HGF)促肝祖细胞增殖；第4阶段加入肿瘤抑制素M(OSM)和地塞米松促肝细胞成熟。通过上述实验流程，最终在体外成功地将hHF-IPSC 分化为具有成熟肝细胞功能的肝样细胞，有望为肝病的治疗提供重要的自体肝细胞来源，具有重要的临床应用前景。

2 hHF-MSC的组织工程学应用前景

Lako 等[11]首先通过向经过致命性照射剂量的小鼠体内移植鼠毛囊毛乳头/鞘细胞重新建立了小鼠的造血系统，陆续有学者进一步证实了啮齿动物毛囊毛乳头/鞘细胞具有MSCs类似的多向分化潜能[12]。Vivek 等[13]发现：HF-MSCs表达 CD90、CD105、CD44 和CD73等间充质干细胞表面标志，但不表达造血细胞(CD34和CD45)和内皮细胞(CD144)标志。通过基因表达、功能分析和克隆实验[14-15]显示：hHF-MSCs 可在体外分化成脂肪、骨和软骨细胞，这与骨髓来源间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)的分化潜能相一致。BMMSC是目前研究最为广泛、最受学者关注、取得研究成果最多，也是最有希望应用于临床的成体干细胞，由于hHF-MSCs与BMMSC的相似性[16]，因此hHF-MSCs的研究越来越受到人们的关注，尤其是hHF-MSCs在组织工程学上的应用前景[17]。

与BMMSC类似，HF-MSCs表达CD90、CD105、CD44和CD73等间充质干细胞表面标志，同时具有成脂、成骨和成软骨细胞分化能力。除此之外，HF-MSC 还具有分化为平滑肌细胞、神经元、神经胶质细胞和黑色素细胞的潜能[18-19]。Yu等[20]将HF-MSCs 置于不含血清和碱性成纤维细胞生长因子的胚胎干细胞培养液中培养，发现HF-MSCs可形成保持数代不分化的神经球，并可维持其不断向肌肉、神经及黑色素细胞分化的能力。Peng等[21]利用血管平滑肌细胞肌球蛋白启动子驱动绿色荧光蛋白的慢病毒质粒，从hHF-MSCs中分离出血管平滑肌细胞，并以该细胞为种子细胞，构建出世界上第一个人毛囊干细胞来源的组织工程小口径血管。该组织工程血管对氯化钾和去甲肾上腺素等激活剂的刺激产生收缩反应[22-23]。进一步研究[24]显示：微小RNA(miR-18b)通过SMAD2信号通路，负调控TGF-β1诱导的hHF-MSCs向血管平滑肌细胞分化。该研究对hHF-MSCs分化过程中的信号通路和调节机制方面进行了深入的探索，为其应用于临床打下基础。

3 hHF-MSCs作为基因治疗的载体细胞

BMMSC被证实具有易于外源性基因导入，转染率高，稳定、高效表达外源基因的特点，成为外来基因导入体内良好的载体细胞。不仅如此，转基因的MSCs 在体内可以定向迁移到受损的病变部位，在激活内源性祖细胞的同时，释放一些生物因子，改善病变组织周围的微环境，修复受损组织[25-29]。转基因MSCs具有双重作用：一方面表达目的基因，治疗相关疾病；另一方面还可以通过旁分泌作用，修复重建病变受损的组织。Wu等[30]首次将hHF-MSCs作为糖尿病基因治疗的靶细胞，通过慢病毒载体将释放可控的人胰岛素基因导入hHF-MSCs中，制备出转基因工程细胞。这种转基因工程细胞仍表达CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs 的特异性标记物，同时具有向脂肪细胞、骨细胞分化的能力；移植到糖尿病模型鼠内，在雷帕霉素的作用下释放胰岛素，逆转糖尿病高血糖，开辟了在临床上转基因治疗糖尿病的新途径，证明了HF-MSCs作为基因治疗靶细胞治疗相关疾病的可行性。本课题组通过应用携带人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor，hHGF)基因的慢病毒转染hHF-MSCs，构建了具有过表达hHGF的转基因hHF-MSCs(HGF-MSCs)。构建的HGF-MSCs仍保留MSCs的生物学特征：表达MSC表面标志，同时具有向骨细胞和脂肪细胞的分化潜能[31]，有望可以应用于急慢性肝损害的修复治疗。上述实验表明：hHF-MSCs可以通过病毒导入其他基因，并不影响其生物学特性。由此可见以自体的hHF-MSC作为基因治疗载体细胞，具有巨大的临床应用潜能。

4 结 语

hHF-MSCs具有如下优点：①来源优势。毛囊基本伴随人的一生，来源丰富；②获取优势。不管是BMMSC还是脐带、脂肪间充质干细胞均存在获取不便的问题，如获取骨髓、脂肪均是有创性操作，取材部位本身即有发生感染的危险，而且取出标本极易被外部环境污染，因此对取材后标本的保存有极其严格的要求。而hHF-MSCs的获取方式已经由研究初期的取头皮、毛囊发展成为直接拔取头发，因此对机体造成的损伤微乎其微；③细胞分离方法优势。HF-MSCs的实验分离方法已经成熟，方法简便，易于操作；④体外扩增优势。利用生物反应器技术，短期内可将hHF-MSCs扩增到数十亿以上，且扩增的细胞仍保留MSC原代生物学特征，因此完全满足临床应用所需的干细胞数量和质量[32]；⑤免疫原性低。hHF-MSCs取材于自体毛发而避免免疫排斥反应；⑥伦理学优势。hHF-MSCs非异体取材，从而避免异体移植所导致的伦理学问题。hHF-MSC的发现时间晚于其他干细胞，目前的实验研究很大部分是基于其他干细胞，如最为常用的BMMSC研究基础之上进行的，因此其存在如下缺点：①其作为体细胞向其他组织、细胞分化的诱导条件及信号通路尚在摸索中[33-35]，因此研究范围有限；②作为转基因治疗手段在活体内的安全性及稳定性尚待进一步证实；③目前国内、外掌握HF-MSCs制备技术的实验室较少，因此获得的实验数据相对较少，尚缺乏HF-MSCs的相关大数据。总之，HF-MSCs作为干细胞家族的一员，目前已经取得的研究成果有力地证明了其将是器官移植、组织工程学和转基因治疗的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。