脐带间充质干细胞治疗战伤的关键技术研究

郭德镔，蔡学敏，阮光萍，朱向情，何 洁，赵 晶，王 强，王金祥，庞荣清，潘兴华

由于高性能大规模杀伤武器的威力更加强大，可能在短时间内导致大批伤情复杂、伤势严重的复合伤伤员，战伤治疗的困难超乎寻常，传统救治观念正在受到挑战。脐带间充质干细胞（UCMSC）具有自我更新、快速生长、多向分化、免疫调节等生物学特点，用于战伤治疗可挽救生命和减少残缺。

1 现代战伤的特点

战伤是人体遭受物理、化学、生物、精神等致伤因素作用后引起的人体结构的完整性与功能破坏，包括创伤、失能、中毒、精神障碍等[1]。战伤特点：（1）武器杀伤威力大、机制复杂、作用时间长、伤情不易判断、救护难度大；（2）一种武器有几种杀伤机制，造成冲击伤、烧伤、机械伤、辐射伤等多种伤情复合出现；（3）高技术武器伤涉及从分子、细胞、组织、器官到整体的损害，常伤及相邻器官、远隔器官，甚至造成全身迟发性反应，检查、治疗困难；（4）可能出现以往战伤中没有见过的微波、次声、激光、超声损伤，新武器、新致伤机制、新伤情；（5）高新武器的使用可导致不见创伤，但内脏器官已严重损害的伤情，伤情隐蔽，常规检查难以识别；（6）易发生应激障碍，心理创伤救治需求突出。

2 UCMSC治疗战伤的原理

战伤实际上是对细胞结构与功能的损害，常继发缺血、感染、炎症等，引起组织细胞变性、坏死、缺失，从而导致组织缺损和器官功能障碍。UCMSC治疗机制是维护细胞的稳态、修复受损的细胞，再生或补充缺失的组织细胞。UCMSC具有自动向损伤组织游走、迁移和归巢的特性，即便通过静脉输入体内，它也可以自己去寻找损伤组织，并迁移、定植于损伤组织中发挥治疗作用[2]。UCMSC向损伤组织归巢，就象炎症反应后大量白细胞迁移到炎症组织一样，能够在损伤组织释放的趋化因子、粘附分子、生长因子、炎症因子、整合素和酶等多种因素的协同作用下，通过趋化因子与UCMSC表面受体结合而驱动并跨越血管内皮细胞，迁移至损伤组织。UCMSC的归巢是一个多步骤、多因子参与的复杂过程，涉及趋化因子的吸引、生长因子（HGF）的调节、整合素的协同、炎症因子的促进、血管内皮细胞生长因子的辅助等。UCMSC特异性归巢决定于损伤组织释放因子的吸引作用，而其表面表达的相应受体决定其是否接受归巢信号的指挥。损伤组织释放的因子与UCMSC表面的相应配体结合后，可驱动UCMSC归巢程序，沿着毛细血管内皮细胞壁滚动，然后通过表达粘附分子、生长因子及整合素家族成员等特异性分子黏附于毛细血管，再通过内皮进入靶组织[3]。

UCMSC可被诱导分化成脂肪、骨、肌肉、神经、胰岛等细胞，具备替代战创伤中损伤细胞和重建组织器官的潜能。在体外诱导UCMSC定向分化，主要是通过在培养体系中添加特定的细胞因子、小分子化合物，或改变培养条件等。在体内，UCMSC的分化具有组织特异性，其分化方向决定于组织微环境的作用。在战伤条件下，归巢到损伤组织的UCMSC可在组织微环境诱导下，定向分化为相应的组织细胞，直接整合于组织中参与损伤修复。在放射伤、系统性炎症、创伤、退变等治疗中发现，不论是通过静脉输入、血管介入、腔隙注射还是定位移植的MSC均显示有治疗作用，可见有部分UCMSC迁移、归巢至损伤组织中，可在组织微环境的诱导下分化为相应组织类型的功能细胞并整合于组织之中，参与损伤组织的结构重建[4]。

UCMSC可分泌20多种涉及细胞生长、分化的细胞因子，包括转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、骨形成蛋白（GMP）、生长分化因子 15、IL-6、结缔组织生长因子（CTGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板生长因子（PDGF）、干细胞生长因子（SCF）等[5]。 体内研究证实，UCMSC通过旁分泌或远程分泌机制促进损伤组织的原位细胞生长。UCMSC分泌SCF、VEGF、NGF的功能比其他MSC更强，促进细胞生长的作用更强大。UCMSC通过直接参与和分泌细胞因子两种机制起协同促进损伤修复。

UCMSC在合适的条件下可分化为血管内皮细胞，形成血管样结构。输入体内的UCMSC可分泌VEGF、TGF-β、HGF 等，这些细胞因子可以有效促进血管内皮细胞生长和微血管再生。体内实验也证实，UCMSC可促进肝肾纤维化、缺血损伤、股骨头坏死组织的微血管再生，改善损伤组织的血液循环和促进缺血性损伤组织的修复。

UCMSC可通过与免疫细胞直接接触和分泌免疫调控因子发挥免疫与炎症调节作用[6]。在体外，UCMSC与外周血单个核细胞接触或非接触培养，均明显抑制T、B淋巴细胞增殖和IFN-γ、IL-2等细胞因子的释放，抑制抗原提呈细胞（DC）的成熟和NK细胞的活性，促进CD4+、CD25+T细胞增殖。在免疫与炎症调节作用中，参与因素有：一氧化氮(NO)、前列腺素 E2(PGE2)、IL-10，TGF-β1、HGF、吲哚胺 2,3-doxygenase(IDO)、甲状旁腺激素(PTH)、BMP 和 IFN-γ等。PGE2是UCMSC发挥免疫调节作用的重要介导因子，而炎症细胞因子IFN-γ、IL-1等能显著上调UCMSC分泌PGE2。UCMSC对免疫功能有双向调节作用，即高剂量抑制血淋巴细胞增殖，低剂量刺激淋巴细胞增殖，在强烈的炎症反应时抑制免疫细胞增殖、炎性细胞浸润、炎症介质合成与释放，在低炎症反应促进免疫功能。

UCMSC 释放的外泌体（exosomes，Exo）也具有传递细胞间信号、清理细胞内“垃圾”以及参与免疫调节的作用[7]。人UCMSC外泌体（hucMSC-exo）可明显抑制CD4+T和CD8+T细胞增殖，诱导CD4+、CD25+FoxP3+Treg细胞比率升高，抑制PBMC产生炎症相关因子，如IFNγ、IL-6、TNF-α，并且具有剂量依赖性。hucMSC-exosome的典型特征是促进损伤修复，在蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA等水平，将特定的内容物传递至靶细胞中，激活或抑制某些信号通路或信号蛋白，通过调节细胞增殖、凋亡、血管再生以及免疫等多种途径发挥组织修复功能。hucMSC-exosome可以降低血管再灌注损伤，促进肾小管上皮细胞增殖和抑制其凋亡，促进神经及血管再生，加快伤口愈合，促进细胞增殖且抑制细胞凋亡。

在UCMSC治疗实验中发现，将猕猴的UCMSC以3×106细胞/kg的剂量输入肺纤维化的老年猕猴体内，1次/w，连续输入3次，3个月后检测发现，肺纤维化程度减轻，脑血流灌注增加，肾小球滤过率提高，同时还可见到外周血中的超氧化物歧化酶（SOD）、端粒酶含量升高。在UCMSC对卵巢衰老小鼠的干预实验中发现，UCMSC可降低衰老相关基因表达水平，提高细胞自噬能力。说明UCMSC可通过提高抗氧化应激能力、促进细胞自吞噬和调节基因表达来促进损伤修复。

3 UCMSC在战伤治疗中的作用

UCMSC具有防治战伤后组织细胞变性、坏死和进行组织损伤的修复、替代等作用。

组织器官功能维护与再生[8]：UCMSC治疗具有减轻继发性损伤、促进损伤再生修复、挽救生命和减低致残率的作用。MSC促进各种组织损伤的修复作用已经在局部或全身性损伤疾病模型治疗研究中得以证实，主要结果有：（1）对机械性、缺血性、中毒性、放射性组织损伤，甚至是一些组织损伤不明确的器官功能障碍性疾病均显示疗效；（2）不同类型的组织损伤，在接受UCMSC治疗后,均发现有一定数量的UCMSC分布及分化，说明UCMSC参与了损伤修复；（3）UCMSC治疗损伤的疗效起决于微环境条件对急性损伤的疗效更显著；（4）对自身免疫、炎症等导致的组织损伤治疗获得了肯定疗效。

防控炎症反应[9]：武器伤导致的烧创伤、缺血及再灌注损伤等易引发伤员过度释放炎症介质，导致系统性炎症反应综合征（SIRS），诱发发多器官功能不全（MODS）。SIRS是机体受到严重伤害引起的炎症反应失控和自我破坏，是导致战伤之后组织器官损伤和非现场死亡的重要原因。SIRS救治关键是控制血液循环中的炎症启动因子、炎症介质及细胞裂解产物的浓度，阻断炎症反应的恶性循环。UCMSC治疗SIR可防止或阻断SIR过程中的细胞因子瀑布效应和炎症介质释放，防止伤情发展。UCMSC具有强大的抗炎和调节免疫功能的作用，不论是给创伤性还是感染性、中毒性急慢性炎症反应的患者输入UCMSC，均可见到炎症反应症状减轻或消失，组织内炎性细胞减少，同时还可抑制组织细胞的凋亡。

组织工程：UCMSC可用于培育具有三维结构的生物组织或器官，并用于组织缺损的修复治疗。目前，包含活性细胞的人工骨、皮肤、血管、角膜等已被研制成功，并在动物模型治疗实验中取得成功。在战伤治疗中，可通过计算机设计，按照需要修复组织的特定尺寸和形状，将UCMSC、生物材料、生长因子等多元材料的混合物通过3D打印的办法，快速、精准制造出符合战伤治疗要求的生物组织，甚至是复杂的组织或器官。将骨髓MCS与可降解生物材料复合培养后移植于骨缺损组织，MSC可增殖分化为骨细胞，形成骨组织。将MSC与特定的粘合剂、生长因子复合，用3D喷墨打印技术将复合材料喷涂在血管支架的内外层上并移植于灵长动物体内取得成功。将VEGF基因转染MSC后与真皮支架材料一起植入全层皮肤缺损的模型，发现可促进人工皮肤的血管化及创面愈合。人工构建包含附属血管、汗腺、皮脂腺等的人工皮肤已获得成功。将生长因子基因导入MSC，可促进皮肤、血管细胞生长和损伤修复。

高新武器伤治疗[10]：高新武器伤涉及基因层面的断裂、突变，大分子功能蛋白的破坏，细胞和组织器官的结构破坏等，常造成组织细胞可逆或不可逆损害，常规药物治疗作用甚微。UCMSC用于高新武器伤治疗具有多重生物效应，可通过直接参与、分泌多种因子和提升抗氧化应激能力等，从基因到整体不同层次发挥治疗作用。在基因水平，UCMSC具有促进DNA修复的功能，能够快速、高效地识别辐射引起的DNA损伤，通过启动同源重组、非同源性末端接合等途径进行DNA双链断裂的迅速修复。在发射性肺损伤治疗中，UCMSC通过分化成肺泡上皮细胞和内皮细胞及细胞因子表达减轻肺水肿，修复损伤的肺组织，提高生存率，而且较低剂量就能迁移归巢至损伤部位发挥作用。在细胞水平，将MSC移植于放射线照射的灵长类动物体内，MSC可分布于全身个组织，促进创伤局部成纤维细胞、内皮细胞、胶原纤维、毛细血管增加。UCMSC治疗持续感染和坏死时，可通过分化和旁分泌作用调节局部微环境平衡，促进创面组织的血管内皮、表皮和成纤维细胞增殖及放射伤创面愈合。在视网膜色素变性、视网膜光损伤、糖尿病视网膜病变等动物模型中，MSC可通过分泌神经营养因子，抑制视网膜炎症反应和病理损害，减轻或延缓视网膜组织损伤。MSC可通过抑制炎症反应节、向肝细胞样分化、抗细胞凋亡、抗氧化应激、促进血管再生等机制治疗微波、贫铀弹等导致的急性肝功能衰竭。

4 展望

UCMSC是所有干细胞中“成药”性能最强的干细胞之一，是一种战伤修复的理想“细胞药品”，对促进战伤中受损伤组织的修复、防控SIRS和构建用于战伤修复的人工组织器官具有特别重要的军事医学价值，特别是对高新技术武器伤治疗具有多种生物效应，满足多层次复合损伤的治疗需求，其他细胞和传统药物难以替代。UCMSC在战伤救治中的优势是材料来源充足，无伦理限制和免疫排斥问题，可以大规模、标准化生产，对战伤治疗具有通用性。本课题组建立了人UCMSC大规模体外制备技术体系，通过对神经、骨、心、肝、肺、肾、胰等局部损伤和放射伤、老年退变、SLE、SIRS等全身性损伤动物模型的UCMSC治疗研究，结果显示异体或异种UCMSC治疗无明显免疫排斥反应，对不同类型的损伤的不同阶段均显示有一定治疗作用，提示UCMSC对各种战伤，在早、中、后期均可发挥治疗作用。UCMSC的作用机制涉及UCMSC定向归巢、分化、分泌生长因子、调节炎症与免疫、促进血管再生和提高抗氧化应激能力等。前期研究解决了UCMSC治疗损伤性疾病临床前关键技术问题，进一步的研究任务是建立临床研究技术及规范，通过临床研究验证UCMSC的疗效与安全性，使其成为战伤治疗的产品和技术。

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