GeneXpert MTB/RIF技术对肺结核的诊断效能评估

赵 平，余 琴，张 喻，陈 亮

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院医学检验科/尿液细胞分子诊断北京市重点实验室 100038；2.北京市朝阳区疾病预防控制中心结核病门诊部 100029)

目前，结核病仍然是世界范围内致死率较高的传染病。2015年，全世界大约有1 040万人新发结核病，140万人死于结核病[1]。我国是全球结核病高负担国家之一，结核病患者数居世界第二位，并且占全球病例数的11%，2015年的发病人数估计在91.8万人[1-2]。缺乏准确、快速的结核分枝杆菌检测方法是结核病治疗管理方面的主要障碍。目前我国结核病防治所和一些综合医院主要依靠痰涂片检查抗酸菌和罗氏固体培养并结合患者临床症状和X线表现来诊断肺结核。结核分枝杆菌培养被认为是最终诊断的“金标准”，但是培养耗时较长，一般2～8周出结果。尽管痰涂片萋-尼氏染色显微镜检查抗酸菌是一种快速并且廉价的检测方法，但是其敏感性较差[3]。因此，依赖于核酸扩增技术的结核分枝杆菌快速检测对患者的早期治疗，改善患者预后以及进行有效的公共卫生干预都非常重要[4]。近几年，多种分子生物学方法已经被用于结核病的诊断和结核分枝杆菌耐药的快速检测，包括线性探针试验、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和GeneXpert MTB/RIF技术等。但是，在我国分子生物学技术检测痰标本中结核分枝杆菌还不是一线检测方法，其检测效能还需进一步确定。本研究对GeneXpert MTB/RIF技术在诊断肺结核方面的能力进行评估，探讨其在基层实验室的应用前景。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年1-6月来北京市朝阳区结核病门诊就诊的疑似肺结核患者治疗前的痰标本240份，每份标本3～5 mL，其中112份来自女性患者，128份来自男性患者，患者年龄16～78岁，中位年龄为36.5岁，疑似肺结核患者的诊断按照《肺结核诊断标准(WS288-2008)》执行。

1.2仪器与试剂 光学显微镜(Olympus，CX31RBSF)、萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色液(珠海贝索生物技术有限公司，BASO)、BACTEC MGIT 960 结核分枝杆菌快速培养系统(M960,Becton Dickinson and Company，Sparks，Maryland，USA)、GeneXpert检测系统和检测试剂盒(Cepheid,Inc,Sunnyvale,CA,USA)。

1.3方法

1.3.1涂片、染色及镜检 每份痰标本先进行涂片，并对涂片进行萋-尼染色，光学显微镜下检查抗酸杆菌。涂片、染色及镜检方法按《现代结核病诊断技术》[5]方法操作。

1.3.2培养及药敏试验 涂片后的每份痰标本被分为两份，一份用L-半胱氨酸氢氧化钠法进行去污染处理[6]。处理后的标本接种在M960液体培养基中，放在M960系统内进行培养，培养方法参照仪器说明书进行。培养阳性的菌株用M960系统进行异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的敏感性试验，方法参照试剂盒说明书。于此同时，阳性菌株接种在对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基上进行初步的菌种鉴定。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF试验 另一份标本按照文献[7-8]及产品说明书进行GeneXpert MTB/RIF试验。即用2.0 mL 的GeneXpert MTB/RIF样本处理液加入到含1 mL痰标本的无菌离心管中，室温静置15 min，期间手动震荡离心管2次，取处理后的标本2.0 mL 加入到测试盒中，将测试盒放入到仪器内进行检测。

1.3.4质量控制 在每批次痰标本进行涂片染色镜检时，以卡介苗菌液涂片为阳性质控，以大肠埃希菌菌液涂片为阴性质控，阴性和阳性质控片各1张。每批次结核分枝杆菌培养和药敏试验均使用标准敏感菌株H37Rv进行质控检测。 GeneXpert MTB/RIF法每个测试进行样品处理质量控制(SPC)和探针检查质量控制(PCC)，同时对H37Rv菌株进行检测。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析，应用χ2检验对涂片、培养和GeneXpert MTB/RIF系统的检验效能进行比较分析，一致性检验采用Kappa检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1质控结果 每批次卡介苗菌液涂片抗酸染色均阳性，大肠杆菌菌液涂片抗酸杆菌染色均阴性；H37Rv质控菌株培养均阳性，异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素的药敏试验均敏感；GeneXpert MTB/RIF试验在检测标本时有1份标本出现质控无效，造成检测结果失败，每批次检测H37Rv时DNA检测均阳性，利福平药敏试验结果均为敏感。

2.23种方法阳性检出情况 痰涂片镜检阳性率为18.8%(45/240)，M960培养阳性率为33.8%(81/240)，GeneXpert MTB/RIF阳性率为36.3%(87/240)。GeneXpert MTB/RIF和M960培养与痰涂片镜检阳性率之间的差异均有统计学意义(χ2=18.49、13.99，P<0.05)，GeneXpert MTB/RIF与M960培养阳性率之间的差异无统计学意义(χ2=0.33，P>0.05)。以M960培养为金标准，GeneXpert MTB/RIF的灵敏度为84.0% (68/81，95%CI：76.0～91.9)，特异度为87.8(129/147，95%CI：82.5～93.1)，阳性预测值(PPV)为78.2%(68/87，95%CI：69.5～86.8)，阴性预测值(NPV)为87.2% (129/148，95%CI：81.8～92.6)；涂片镜检的灵敏度为51.9%(42/81，95%CI：41.0～62.7)，特异度为98.6(145/147，95%CI：96.8～100.0)，PPV为93.3%(42/45，95%CI：86.0～100.0)，NPV为75.1% (145/193，95%CI：69.0～81.2)。GeneXpert MTB/RIF和涂片镜检在灵敏度、特异度、PPV和NPV之间差异均有统计学意义(χ2=19.15、13.73、4.92、7.68，P<0.05)。

2.33种方法阳性检出时间比较 GeneXpert MTB/RIF系统阳性结果报告时间(从标本处理到阳性结果报出)为2.5 h；痰涂片显微镜检查报阳时间平均为3.5 h(包括涂片、干燥、染色及镜检时间)；M960培养系统阳性报告时间平均为12 d，培养42 d无结核分枝杆菌生长报告培养阴性。

2.4药敏试验结果比较 GeneXpert MTB/RIF检出7例利福平耐药，耐药率2.9%(7/240)，M960系统比例法药敏试验检出4例利福平耐药，6例异烟肼耐药，8例链霉素耐药，8例乙胺丁醇耐药，利福平耐药率1.7%(4/240)，两者比较差异无统计学意义(χ2=0.84,P>0.05)。GeneXpert MTB/RIF检测出7例利福平耐药，其中4例M960系统药敏试验显示为利福平耐药，并且是耐多药，2例M960系统培养阴性，1例M960系统药敏试验显示为利福平敏感。

2.5GeneXpert MTB/RIF和M960系统一致性分析 两种方法检测结核分枝杆菌的一致性为82.8%，Kappa值为0.73(95%CI：0.61～0.86)。

2.6GeneXpert MTB/RIF和M960系统不一致分析 所有标本中有19份标本GeneXpert MTB/RIF系统检测阳性，但M960系统培养阴性，通过查阅患者病历，这19例患者中有15例被医生诊断为肺结核，并进行了相应的治疗，治疗后病情好转。有4例被诊断为肺结核陈旧灶或稳定灶，未进行抗结核治疗。

3 讨 论

GeneXpert MTB/RIF系统是一种自动、快速的分子诊断设备，集标本处理和半巢式PCR于一体的结核分枝杆菌鉴定和利福平耐药检测设备，其操作简单、方便[8]。在HIV高流行或结核病高耐药地区此技术已经作为疑似肺结核的一线检测方法。

GeneXpert MTB/RIF试验以半巢式PCR为基础，此技术将PCR的样品准备、DNA扩增和DNA检测3个步骤整合在一起。样品处理后加入到测试盒中，在微流样品盒里完成DNA提取的所有复杂步骤，并可将提取的DNA进行浓缩和纯化，以增加测试的灵敏度。浓缩纯化后的标本DNA进入微反应管中，并在其中扩增至被检测到。DNA提取、检测的整个过程均在仪器配套的密闭的测试盒内完成，完全实现自动化，避免人为因素的污染。其对DNA序列的检测具有高度光学敏感性，实时的荧光监测使得软件一经发现目标序列即可及时给出结果，极大缩短了检测时间，检测全过程仅2 h。

本研究对 GeneXpert MTB/RIF在临床痰标本中检测结核分枝杆菌的检测效能进行了初步评估。以前的研究显示，以M960培养为标准，GeneXpert MTB/RIF系统检测结核分枝杆菌的灵敏度为86.2%～97.1%，特异度为95.3%～99.4%[9-11]。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF系统检测结核分枝杆菌的阳性率为36.6%，明显高于涂片检查(18.49%)，差异有统计学意义(P<0.05)，略高于M960液体培养系统阳性率(34.0%)，差异无统计学意义(P>0.05)。其灵敏度和特异度分别为84.0%和87.8%，与以往的研究结果相似。

涂片镜检的阳性率明显低于GeneXpert MTB/RIF方法和培养，主要是因为其方法的局限性，每毫升标本中需要1 104～5 103个菌才能检出[12]，GeneXpert MTB/RIF方法每毫升痰标本需要131个标本就能检出[7]，而将痰标本离心浓缩后培养其阳性检出限可达到10～100 CFU/mL[12]。

本研究中，与M960培养系统比较，GeneXpert MTB/RIF系统显示出了较好的阳性检出率，与M960系统具有较好的一致性，并且阳性检出时间明显短于培养方法，这对早期发现患者，快速诊断、及时治疗患者非常重要。

本研究中有19份标本GeneXpert MTB/RIF检测阳性，但M960培养阴性，13份标本GeneXpert MTB/RIF检测阴性，但M960培养阳性。这可能主要是因为标本中的菌量在检测方法检出限水平附近时，在检测过程中受到外界的影响较大，如标本采集、标本的处理等都可能影响到检测结果的准确性。另外，GeneXpert方法是检测结核分枝杆菌DNA，包括活菌和死菌的DNA。而M960培养只能检测到活菌，因此，在标本处理过程中被杀灭掉的结核分枝杆菌不能被M960系统检测到，而GeneXpert系统可能检测出。一些标本被M960系统检测出结核分枝杆菌，而GeneXpert系统未检测出，可能是由于标本中菌量未达到GeneXpert系统的检出限。

结核分枝杆菌中的rpo B基因是利福平耐药基因，95%以上对利福平耐药的结核分枝杆菌有rpo B基因的变异。GeneXpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性是以rpo B基因为靶基因。仪器自动提取结核分枝杆菌DNA后，对rpo B基因的192 bp片段进行检测，并采用6种分子信标同时检测6种探针，其中5个相互重叠分子探针(分别以探针A-E命名)选择性覆盖rpo 基因的81 bp核心区，检测结核分枝杆菌存在的同时可以探知利福平是否耐药。 本研究显示，7例对利福平耐药，其中4例M960显示利福平耐药，2例M960培养阴性，1例显示敏感。有文献报道，以常规药敏试验为检测利福平耐药的金标准，GeneXpert MTB/RIF技术对利福平耐药的灵敏度和特异度分别为94.1%和97.0%[13-14]。另外，有大约86%的利福平耐药菌株同时对异烟肼耐药，因此，在利福平耐药的情况下，一定程度下可作为耐多药结核分枝杆菌的监测指标[15]。 由于本研究中耐利福平病例数较少，因此其药敏结果与M960药敏结果的比较还需进一步研究。

综上所述，GeneXpert MTB/RIF系统技术操作简便，阳性检出率和敏感性均较高，并且不需较高的专业技能，普通技术人员经过基本的培训即可操作。因此，该方法在我国基层实验室对结核病诊断及利福平耐药患者的筛查有一定的应用前景。

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