EB病毒检测及其临床应用的研究进展

张 旭

（绵阳市404医院检验科，四川 绵阳 621000）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种嗜淋巴细胞的双链DNA病毒，属于疱疹病毒γ亚科。从1964年发现EBV至今，被证实的EBV感染所致疾病越来越多，在正常人群中EBV的感染率 ＞90%，且为终生携带，患者一般没有临床症状，一旦进入活动期，可引起相应的疾病，甚至导致肿瘤的发生。EBV主要感染B淋巴细胞或鼻咽部上皮细胞，引起的疾病主要包括：淋巴瘤，鼻咽癌以及一些良、恶性的淋巴组织增生性疾病。

目前针对EBV的检测技术日趋成熟，通过EBV DNA的定量检测，可以评估鼻咽癌的发生风险，提前检测和预防某些器官移植后出现的不明原因感染，同时对EBV相关肿瘤的动态监测、预后评估也有积极的意义。EBV感染者通常有外周血淋巴细胞的升高，伴异型淋巴细胞以及转氨酶的升高，但这对EBV感染诊断的帮助作用微乎其微。而EBV感染者血清中的相应抗体，能在一定程度上反映疾病的发展趋势，但不能呈现活动期病毒的具体数量，随着聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的不断发展，可以在外周血浆中动态监测EBV DNA随肿瘤消长的变化情况，配合EBV血清学的检测，可为肿瘤的诊断、分期、治疗、预后等提供更好的依据。本文就EBV的检测方法和EBV相关肿瘤的研究进展作一综述。

1 EBV的检测方法

目前针对EBV的实验室检测方法主要有病毒培养、免疫学检测、EBV DNA载量检测三大类。

1.1 病毒培养

由于EBV存活需要宿主细胞，故体外培养有一定的局限性，如取材一般需要急性期患者的唾液或淋巴细胞，培养的时间较长，阳性率低，一般在临床检测中较少应用。

1.2 免疫学检测

1.2.1 血清学检测 EBV有5种抗原成分，分别为衣壳抗原（viral-capsid antigen，VCA）、膜抗原（membrane antigen ，MA）、早期抗原（early antigen，EA）、补体抗原（可溶性抗原S）和EB病毒核抗原（Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA），各种抗原均能产生相应的抗体，并出现在EBV感染的不同阶段，实验室常用酶免疫法或免疫荧光技术检测不同感染阶段产生的抗体。在EBV感染的早期，通常EA-IgM和VCA-IgM会显著升高，因此IgM抗体是急性EBV感染的标志物；而感染6周后，VCA-IgG也会维持在一个较高的水平，同时EBNA-IgG在感染7个月后也会达到顶峰，并长期维持在较高水平，故IgG抗体阳性是EBV既往感染的证据。此外，在原发性EBV感染的早期，采用流式细胞仪可以检测到抗早期裂解抗原的血清IgA抗体[1]，如VCA-IgA、EA-IgA。

1.2.2 免疫组化法 对于自然杀伤（natural killer，NK）/T细胞淋巴瘤（鼻型）、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）等瘤组织的EBV潜伏膜蛋白1（latent membrane protein-1，LMP-1）可通过免疫组化法进行检测。该方法可使胞质和胞膜的LMP-1着色，因此能客观表现出被感染细胞中EBV的蛋白表达情况，但不能检测病毒的定位和转录数量[2]。

1.3 EBV DNA检测

EBV以环状DNA形式存在于淋巴细胞胞浆中，90%的人为潜伏性感染，只有活动期的EBV可破坏淋巴细胞，进入血液循环，绝大多数的血浆游离DNA片段大小为82～181 kb，因此可采用PCR检测血浆中游离DNA的含量。目前，根据是否定量可将PCR分为常规PCR、半定量巢式PCR和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction，qPCR）。有研究表明，针对EBV扩增的目的片段主要包括EBNA-1、EBNA-2、EXLF-1基因及Bam HI-w区域[3]。因Bam HI-w区域是EBV的高度保守和高度重复序列，检测该片段能够提高临床检测的敏感性及特异性，故临床实验中多用Bam HI-w区域作为检测的目标区域。EBV qPCR检测可用于干细胞移植患者感染EBV的风险评估[4]，评价EBV治疗的疗效，如血液中病毒载量低于检测水平或至少＜1 000拷贝/mL证明治疗有效[5]。史会萍等[6]利用半定量巢式PCR分析了人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者唾液酸中EBV DNA的表达情况，并取得了较好的阳性检出率。

也有学者通过生物素标记的EB病毒编码的小分子质量RNA（Epstein-Barr virus-encoded small RNA，EBER）-1寡核苷酸探针原位杂交技术检测淋巴瘤组织中的EBV mRNA，在血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤中EBER-1 mRNA的总阳性率分别为61.5%和81.8%[7]。采用原位杂交技术检测EBER被认为是检测肿瘤细胞中EBV的金标准，其敏感性和特异性均高，EBER-1染色为胞核着色，结果清晰，容易辨认，反映的是DNA转录情况，但实验周期较长（36～40 h），过程较为繁琐。

血清学检测是诊断EBV感染的有效方法，但只能作为病毒感染的指标，不能准确反应出体内EBV感染的复制情况，而用qPCR定量分析可以准确测定出病毒载量。由于血浆EBV DNA仅存在于病毒血症期，EBV感染2周后开始迅速下降，尤其在退烧后可能检测不到，但EBV VCA-IgM水平反而逐渐升高，故联合检测EBV VCA-IgM及血清EBV DNA可提高EBV现症感染的诊断率[8]。

2 EBV检测指标在临床中的应用

2.1 EBV与鼻咽癌

大量的研究表明，EBV阳性是患鼻咽癌的高危因素。在鼻咽癌患者中，EA-IgG、Rta-IgG、VCA-IgA的表达量比正常人或鼻炎患者都高，这3个抗体结合EBV DNA检测的敏感性达98.21%，阴性预测值达98.61%[9]。TAN等[3]通过检测游离EBV DNA，得出鼻咽癌患者EBV DNA的阳性检出率明显高于正常人群的结论。血清中的EBV DNA是肿瘤源性的，且肿瘤细胞凋亡与血浆EBV DNA有着密切关联。朱超纲等[10]的研究也表明EBV DNA水平与鼻咽癌的TNM分期呈正相关。对于鼻咽癌患者的预后，其DNA水平越高提示预后越差。LEUNG等[11]研究认为，血浆EBV DNA水平是总生存期的独立预后因素，仅次于UICC分期。对于Ⅰ、Ⅱ期患者来说，高的血浆EBV DNA水平提示预后不良，高血浆EBV DNA水平组与Ⅲ期患者的生存期望相同或更差，反之，低血浆EBV DNA水平组的生存期望与Ⅰ期患者相同。此外，Ⅲ期鼻咽癌患者EBV的水平是重要的独立预后因子，并且具有很强的远端转移能力[12]。WANG等[13]的研究表明EBV DNA清除半衰期短的患者比半衰期长的患者有较好的完全缓解率和较长的总生存期，这表明治疗第1个月的EBV清除率是重要的独立预后预测因子。由此表明，EBV DNA的检测在鼻咽癌的早期诊断、临床分期、疗效监测、预后判断等方面均有重要的临床意义。

2.2 EBV与淋巴瘤

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）主要包括Burkitt's淋巴瘤，NK/T细胞淋巴瘤、弥漫型大B细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞淋巴瘤等，其中Burkitt's淋巴瘤是最早被证实与EBV感染相关的淋巴瘤。回顾性调查显示，高拷贝的EBV DNA在很大程度上与NHL有相关性[14]。对于HIV感染的Burkitt's淋巴瘤患者，有30%～40%显示出EBV阳性[15]。在大多数EBV阳性的Burkitt's淋巴瘤中，EBNA-1、EBER和LMP-1均呈高表达，并且EBNA-1与EBV基因组的复制和稳定性相关，是维持病毒潜伏感染所必需的。林云等[16]的研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）-127和miRNA-155的高表达与儿童Burkitt's淋巴瘤密切相关，并且其表达也受EBNA-1的调控。结外NK/T细胞淋巴瘤的发病机制与EBV感染相关，几乎所有病例都含有单克隆游离EBV DNA，并可检测到EBER。除了检测血浆中的EBV，如果能及时检测脑脊液中EBV DNA 的含量将有助于结外NK/T细胞淋巴瘤的诊断[17]。ABADI等[18]的研究显示，在弥漫型大B细胞淋巴瘤中EBV的阳性率高达50%。在EBV阳性的弥漫型大B细胞淋巴瘤中EBV DNA呈高表达，并能增加IgG对EBV编码的抗原的裂解作用[19]。

HL也与EBV的感染密切相关。有研究发现，HL患者EBV的阳性率高达52.5%。一项来自丹麦和瑞典的报告指出，在传染性单核细胞增多症后发生EBV阴性HL的风险并未升高，但发生EBV阳性HL的风险有所升高，从传染性单核细胞增多症至EBV阳性HL的中位潜伏时间为4.1年[20]。在里德-斯坦伯格（Reed-Steinberg，RS）细胞中检测到的EBV DNA具有克隆性，提示感染该病毒的人群源于单个感染细胞。此外，EBV DNA拷贝数是评价EBV相关HL预后的重要指标[21]。有研究结果表明，当血浆EBV基因组拷贝数的临界值设定为＞60拷贝/100 μL血浆时，结果与原位杂交法的一致性为96%，与治疗前血浆EBV值较低的患者相比，治疗前血浆EBV值＞60拷贝/100 μL患者的无失败生存率更低，在多变量分析中，治疗前血浆EBV是治疗失败的独立预后因素[22]。

移植后淋巴细胞增殖性疾病（post-transplant lymphoproliferative disorder， PTLD）是造血干细胞移植和实体器官移植后的一种少见致死性并发症，大约有90%的PTLD与EBV感染相关[23]。由于B淋巴细胞膜上有EBV特异性受体，所以人体B淋巴细胞对EBV具有易感性，在正常情况下EBV基因组存在于静止状态的记忆B淋巴细胞中，当机体免疫功能低下时，B淋巴细胞增殖失去T细胞的调控，导致EBV再激活、复制，并与B淋巴细胞基因组整合，引起EBV在B淋巴细胞内无限增殖，最终导致B淋巴细胞单克隆性或多克隆性增生。对于PTLD的监测，EBV载量具有极其重要的作用[24]。

2.3 EBV与其他疾病

在胃癌患者中，也有一部分患者是由EBV导致的EBV相关性胃癌。韦华军等[25]的研究显示，EBV miRNA 在低分化胃癌中均呈高表达，EBV miRNA-BART5和miRNA-BART7在中、高分化胃癌中的表达水平差异具有统计学意义（P＜0.05），可作为EBV相关性胃癌无创性诊断、治疗和预后判断的生物标志物，但EBV miRNA-BATR1、miRNA-BATR2和miRNABATR10表达差异无统计学意义（P＞0.05）。外周血EBV DNA载量不能全面评估EBV相关性中枢神经系统疾病的发生、发展及疗效，脑脊液EBV DNA载量作为EBV相关性中枢神经系统疾病发生、发展及疗效评估的指标优于外周血EBV DNA检测[26]。此外，在一些EBV阴性的T淋巴细胞增殖性疾病中，经过干细胞移植后会出现EBV阳性，肝组织活检可见CD8+T淋巴细胞有EBV的侵袭[27]。

EBV感染可致噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）[28]，表现为大量淋巴细胞活化、增殖，大量细胞因子的释放并产生级联反应，引起细胞因子风暴，诱发严重的自噬、自溶现象，血液中EBV DNA呈高拷贝数水平。分子生物学检测结果是诊断慢性活动性EBV引起的HLH的重要依据。

目前，已有大量研究证实平滑肌肉瘤与EBV感染密切相关，且EBV相关性平滑肌肉瘤一般合并HIV感染或器官移植。对于平滑肌肉瘤患者而言，EBV相关性平滑肌肉瘤具有较好的预后，而非EBV相关性平滑肌肉瘤往往伴随着血流播散和远端转移，在EBV相关性平滑肌肉瘤中由肿瘤引起的死亡仅占6%[29]。通过原位杂交技术检测肿瘤组织中EBV的核酸表达，将有助于诊断EBV相关性平滑肌肉瘤[30]。

3 EBV感染的治疗

目前，对肿瘤或其他疾病合并EBV感染的治疗方式主要有：（1）抗病毒和免疫调节治疗。更昔洛韦，干扰素α（interferon alpha，IFN-α），EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞，丙种球蛋白。（2）免疫化疗。（3）联合化疗。（4）难治的病例采用造血干细胞移植。（5）EBV相关的淋巴增生性疾病可以在允许的条件下将免疫抑制剂的剂量降低或停用[31]。（6）裂解诱导法。通过将隐性感染转化为进行性感染，使感染的肿瘤细胞裂解，而正常细胞不受到破坏[32]。此外，通过基因工程制备的EBV载体疫苗携带大量线性连接的EBV特异性抗原基因序列，当其进入患者体内后可表达为多肽，EBV特异性CTL可特异识别并诱导相关的免疫反应。

更昔洛韦和爱昔洛韦是治疗疱疹科病毒的药物之一，但对EBV感染的疗效迄今尚未得到肯定。有研究显示，短期、间断应用丁酸可有效提高EBV感染淋巴瘤中隐性状态细胞对抗病毒药物（核酸类似物）的敏感性[33]，对于EBV在B淋巴细胞中复制的患者，BALAMUTH等[34]采用CD20单克隆抗体（利妥昔单）治疗显示，给药24 h后，EBV滴度可显著下降。对于EBV相关NK/T细胞淋巴组织增殖性疾病、慢性活性EBV感染及难治性或反复发作的EBV-HLH患者，可尝试给予EBV特异性CTL治疗。很多移植中心已将EBV监测整合到了PTLD高风险患者的常规评估中，利妥昔单抗抢先治疗或减低免疫抑制的方法最适于EBV相关PTLD高风险患者的治疗[35]。

目前人们对EBV的检测越来越深入，由EBV感染引起的疾病也越来越被重视，加大对临床可疑病例血浆EBV DNA的筛查，能及时找出致病原，缓解病情。加强EBV感染者EBV DNA的监测力度，将有利于了解相关疾病的发生、发展进展，不断改善治疗方案。现阶段，与EBV相关肿瘤的研究已取得了良好的进展，但其具体的治疗方案还需进一步探索。相信在不久的将来，随着检测技术的改进以及实时检测的发展，由EBV感染引起的相关疾病会得到很好的控制，降低肿瘤的发病率，提高肿瘤的治愈率，改善医疗水平。

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