脱钙骨基质在骨缺损修复中的应用与改性研究概况

孙梦洁 金巨楼 杨军星 宋立杰 卢亚东 王博蔚 刘志辉

创伤、感染、肿瘤、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因，骨移植作为骨缺损修复的常用手段，其材料包括自体骨、同种异体骨、异种或人工合成骨移植材料。理想的移植材料必须具有足够的成骨能力、骨诱导及骨传导能力。脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）作为自体骨移植的替代材料，是去除了无机成分的骨。因具有良好的骨诱导、骨传导及促成骨能力，自1965年Urist[1]首次提出DBM具有骨诱导能力以来，其对于骨缺损的修复一直受到人们的青睐。

一、DBM促成骨机制

在体外采用一系列化学方法对同种异体骨行脱钙、去脂处理后，成为含有Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅹ型胶原蛋白，非胶原蛋白，生长因子，少量磷酸钙及细胞碎片的混合物[2]，即DBM。临床DBM来源可以为松质骨或皮质骨，正常人干燥骨在脱矿的过程中，表面的抗原结构被去除，抗原性降低。在骨修复和重建过程中，骨基质可提供多种蛋白质及生长因子，包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）[3]。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是多功能细胞因子，属于TGF-β超家族。在已发现的BMPs中，BMP2、4、7具有成骨潜力。由于BMPs的存在，使得DBM具有促成骨能力。在骨形成的过程中，BMPs与细胞膜表面的Ⅰ、Ⅱ型受体结合，使细胞内Smad1、5、8蛋白磷酸化，磷酸化的蛋白从受体释放后，与Smad4蛋白结合形成复合物进入细胞核。在成骨细胞中，该复合物与其他转录因子如Runx2结合，参与目的基因的转录[4]。Runx2与激活的Smads蛋白两者之间的协调活动为骨架形成的关键。除Smads蛋白信号转导通路之外，BMPs还可通过丝裂原活化蛋白激酶如p38MAPK信号转导通路，作用于Runx2基因，控制间充质前体细胞的分化[5]。除BMPs外，DBM中还含有少量的IGF、FGF、VEGF、PDGF，这些生长因子除促进血管的形成外，还有利于间充质细胞的增殖和成骨细胞的招募[6]。

二、基于骨诱导性DBM在骨缺损修复中的单独应用

使用自体骨和异体移植物修复骨缺损时，成功的骨诱导依赖于未分化的干细胞具有高的分化、成骨能力，以取代受伤的终末分化细胞。DBM因含有BMPs，可刺激植骨区周围间充质干细胞向成骨细胞分化，促进新骨形成，具有骨诱导性，可单独应用DBM修复骨缺损。

骨缺损区应用DBM可促进骨修复，Lee等[7]在双侧下颌升支矢状劈开截骨后，对植入DBM与未植入对照组应用CBCT分析骨增量，发现前期两组骨体积均增大，但术后第6个月DBM组体积增加依旧明显，对照组体积几乎不变，表明DBM可促进骨的形成。

因DBM具有一定的孔隙率，与周围组织的生物相容性及自身的可降解性，使得DBM也可作为促成骨因子及相关药物的载体[3]。Huber等[8]以DBM作为BMP-2的载体，在体外实验中BMP-2有效成骨浓度可保持56天，在动物骨缺损模型中，与自体骨移植及空白对照组相比，负载BMP-2的实验组表现出强大的诱导成骨特性。对于感染造成的骨不连，Lewis等[9]的研究表明，DBM作为抗生素的载体，在体外试验中，负载庆大霉素的DBM，可至少保持13天临床药物释放水平，加载的抗生素不影响DBM的骨诱导性。

三、基于骨诱导性DBM在骨缺损修复中的联合应用

DBM制备过程中，骨的无机成分丧失，生长因子的活性也受到一定影响，使其力学性能及促成骨能力下降。为提高修复效果，DBM常与其它植骨材料联合使用。在临床使用过程中，DBM可以联合自体骨/骨髓、无机材料、有机材料、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白等，以实现缺损区骨的重建。

1.DBM联合自体骨/骨髓修复骨缺损：DBM作为天然聚合物具有生物相容性，常与自体骨联合应用修复骨缺损，可减少自体骨移植量，尽可能的减少供区并发症。骨髓中存在丰富的干细胞及生长因子，与DBM联合应用可以促进植骨区的骨重建。在治疗胫骨缺损行牵张成骨术时，术区联合植入DBM与自体骨髓，可提高对接位点的融合率，缩短治疗时间[10]。

2.DBM联合无机材料修复骨缺损：DBM为酸提取的有机基质，其主要成分为胶原蛋白。由于生物体内蛋白酶的存在，胶原蛋白在生理环境中易降解，与自体骨相比，DBM结构相对不稳定。将天然无机材料（如羟基磷灰石）或人工合成无机材料与DBM联合，可提高移植物的力学强度。在长骨粉碎性骨折行坚强内固定术后，Ayoub等[11]对DBM、β-磷酸三钙混合移植修复骨缺损的结果进行回顾性分析，发现混合移植可很好的替代自体骨移植。

3.DBM联合有机材料修复骨缺损：在制备DBM过程中，骨脱脂后可能引起自身骨诱导性下降。卵磷脂是骨钙化前脂质的主要成分，Han等[12]将DBM与卵磷脂混合材料放入前腹壁肌肉或皮下，28天后可观察到骨的形成。在DBM中加入卵磷脂可增加材料的骨诱导性，当DBM中卵磷脂含量为60%时，复合材料的骨诱导显著增强。聚乳酸为多孔的有机材料，在修复兔桡骨节段性骨缺损时，联合应用DBM与聚乳酸后，骨重建效果与自体骨移植相似[13]。

4.DBM联合富血小板血浆修复骨缺损：富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是将全血离心后，得到的富含高浓度血小板的血浆，体外加入凝血酶后呈胶状。许多生长因子包括PDGF、VEGF、TGFβ1-2及FGF在血小板颗粒中沉积，刺激存在时这些生长因子的释放有利于血管的形成，从而促进骨的重建，有研究表明应用PRP可辅助长骨缺损的愈合[14]。在体外试验中，将来自犬脐带基质的间充质干细胞与PRP、DBM共培养，21天后OPN及骨钙素基因表达明显增多，间充质干细胞表现出成骨潜力[15]。然而一些学者在动物实验或临床应用中，发现DBM与PRP联合应用修复骨缺损时，两者的协同效果不明显[16～18]。原因可能与凝血酶的活性及PRP的浓度有关[17，18]。Han 等[19]就 PRP 中凝血酶活性对DBM骨诱导性的影响进行研究，发现在体外试验中，加入凝血酶可以激活血小板使其释放大量生长因子；在体内凝血酶的活性对整个成骨过程起抑制作用，只有无凝血酶活性时，PRP可显著增加DBM的骨诱导性。目前对于PRP的体内应用，是否需要加入凝血酶激活血小板尚存在争议，此外联合应用时PRP最佳浓度的确定仍需进一步的实验。

5.DBM联合富血小板纤维蛋白修复骨缺损：富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是全血离心后继PRP得到的第二代血小板浓缩物，其内含有 PDGF、VEGF、TGF-β1、IGF-1 等生长因子，通常被用作自体骨或异体骨移植的辅助物。在骨愈合过程中，血小板中生长因子的释放对细胞的增殖、基质的产生、骨的形成和胶原蛋白的合成起至关重要的作用。PRF中致密的纤维蛋白基质，使得白细胞和血小板中的生长因子缓慢释放，有利于骨重建。Chandradas等[20]对PRF与DBM联合应用与否对牙槽骨内缺损的修复效果进行评估，发现PRF有利于牙周病导致的牙槽骨缺损的愈合，与DBM联合应用效果增加。在临床实验中，将60例牙周病引起的牙槽骨内缺损患者分为两组，分别应用DBM及DBM+PRF修复骨缺损，12个月后从牙周袋深度、临床附着水平、牙龈退缩及X线影像结果进行评估，发现两种治疗方式均引起临床和放射学参数的改变，DBM+PRF组效果更加显著[21]。然而，在实行上颌窦提升术的动物模型中，PRF与DBM或异种骨胶原联合应用并不能明显促进骨的形成[22]。Panda等[23]就自体血小板浓缩物对骨内缺损修复的结果进行系统性回顾及Meat分析，结果表明目前仍缺乏足够的证据证明PRF与移植材料的联合应用的效果。DBM与PRF对骨的重建是否存协同效应仍需进一步的实验。

四、基于骨传导性DBM作为骨组织工程支架修复骨缺损

在生长发育过程中，骨的再生需要细胞和生长因子在时间、浓度和特定组织部位的协调配合作用。DBM作为多孔的、可生物降解的骨替代材料，具有骨传导性。在修复骨缺损时，骨组织可沿DBM表面或其内部孔隙延伸，DBM支架还为新生毛细血管的长入提供平台。随着矿物质在缺损部位的沉积、新骨形成，DBM在体内逐渐降解。因DBM的三维空间结构和力学传导性能，近年来对DBM的研究主要集中在将其作为骨组织工程的支架，复合成骨相关细胞或生长因子替代自体骨移植。通过DBM支架负载多种细胞和生长因子，实现细胞和生长因子在时间和空间上的整合，可最大限度的提高骨缺损的修复能力。

鉴于DBM临床长期使用历史、商业来源的多样性及与传递的细胞和周围组织的生物相容性，通过加载技术及降解动力学控制生长因子的释放，DBM作为骨组织工程的支架材料具有很大的优势。Liang等[24]采用CBCT对牙槽突裂患者骨移植修复术后的骨增量及骨密度进行评估，发现rh-BMP2/DBM支架联合移植修复效果与自体髂骨移植无明显差异。Hammoudeh等[25]对501例牙槽突裂修复术进行回顾性分析，rh-BMP2/DBM可很好的替代自体髂骨移植。

在临床应用中，骨组织工程移植仍存在一些问题。研究表明，细胞接种密度及氧的供应可影响组织工程骨移植的质量[26]。不同的培养环境，如细胞密度的不同，可对种子细胞的生长动力学及基因的表达模式产生影响。植入区周围血管中的氧和营养物质的运输距离较短，只能为DBM支架表面的细胞提供营养，常导致骨移植失败。此外，对于广泛的骨缺损，若组织工程骨的血管化不能有效形成，种子细胞由于缺氧、凋亡以及位于移植物中心的坏死，常导致修复失败。

五、DBM支架的改性

DBM具有良好的生物相容性及生物降解特性，但作为骨组织工程支架，仍具有一些不足，如负载种子细胞及生长因子的数量及能力有限，只能在一定程度上实现骨重建；脱钙后DBM的机械强度降低，不能承担植入位点的机械应力等。通过对支架的改性可弥补其存在的不足。

1.DBM支架表面纳米改性：通过新工艺制备纳米级DBM，其表面形成的不规则纳米沟槽使自身表面积/体积比增加，可促进间充质干细胞的黏附及基质的分泌，利于骨修复。Leszczak等[27]通过静电纺丝技术制作纳米DBM，并与人皮肤成纤维细胞共培养，检测结果表明支架对人皮肤成纤维细胞无毒性反应，具有良好的生物相容性。

2.DBM支架表面修饰：通过生长因子与DBM支架表面的结合，对支架表面修饰后，支架中生长因子的持续释放，可增强植入位点的生长因子水平利于缺损区骨的愈合。在大鼠颅骨缺损模型中，Horváthy等[28]将血清白蛋白涂布于DBM表面，体外观察到大量干细胞附着，体内植入区新骨的密度、机械强度高于DBM组。胶原结合基质细胞衍生因子 -1α （collagen-binding stromal-cell-derived factor-1，CBD-SDF-1α）对骨髓间充质干细胞具有趋化作用，与此同时还可抑制破骨细胞的生成，在大鼠股骨缺损模型，CBD-SDF-1α修饰的DBM支架在植入后可招募内源性干细胞在骨缺损部位的聚集，有助于骨缺损部位矿物质的累积及骨体积的增加，术后检测到骨桥蛋白、骨钙素表达显著增加，同时新生骨强度优于DBM组[29]。组织工程骨移植术后血管再生对骨再生至关重要，促进血管生成的生长因子修饰后的支架利于移植材料的血管化。骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）可促进细胞增殖、迁移以及多种黏附分子的表达，在体内外具有强有力的促血管生成作用。一些学者[30]在裸鼠皮下成骨模型中，Micro-CT扫描及组织学分析结果表明，EV修饰的DBM支架可促进血管生成及骨再生。但如何控制植入位点周围的有效生长因子浓度以及生长因子的有序释放仍是一个亟待解决的问题。

3.DBM支架仿生学改性：利用短肽对DBM支架行仿生学改性，可提高支架对细胞和生长因子的黏附能力。短肽可均分DBM孔径，其作为细胞黏附受体的配体，除促进细胞黏附外，因短肽中氨基酸带有一定的电荷，可吸引带异电荷的生长因子。一些学者[31，32]的研究表明，利用自组装肽修饰DBM支架后可富集更多的细胞及生长因子，有利于骨的重建。

4.DBM支架再矿化：DBM的再矿化有利于承受植入位点的机械应力，利于骨重建。DBM作为骨组织工程支架，具有很强的抗拉强度及骨诱导性，其主要不足是矿物成分的缺乏造成的低机械稳定性。近来一些学者使用含钙溶液交替浸泡DBM后，孔隙内磷酸氢钙等矿物质的沉积使支架的抗压强度提高，与间充质干细胞共培养时，细胞的增殖及分化不受影响，此外成骨基因的表达显著增加[33，34]。

DBM除作为骨移植替代物，还可充当成骨因子及药物的载体。骨组织工程为细胞的黏附、迁移、增殖和分化提供成骨微环境，基于DBM支架的骨组织工程移植在骨缺损修复方面具有广阔的发展前景。DBM作为骨组织工程支架，种子细胞的接种密度、生长因子的黏附水平、DBM的机械性能以及骨组织工程的血管化均影响骨缺损修复的效果，对DBM支架材料改性后可弥补其存在的不足，为最大程度实现骨重建，改性方法需不断的优化。