Th17细胞及IL—17表达水平在脊柱结核患者病情发展中的意义分析

卓祥龙

摘要目的：探讨脊柱结核外周血中Th17细胞的数量变化及IL-17表达，寻求治疗新靶点。方法：收治脊柱结核患者30例，选择健康者30例，均检测外周血单核细胞中Th17细胞比例和血浆中IL-17含量。结果：脊柱结核组治疗前Th17细胞数量高于健康组（P<0.05），结核组术后12个月的Th细胞数量和IL-17量较术前明显降低（P<0.05）。结论：Th17细胞和IL-17因子是介导脊柱结核病情发展的重要免疫因素，Th17细胞和IL-17可能是脊柱结核患者在细胞免疫治疗方面的一个新靶点。

关键词Th17细胞；IL-17表达水平；脊柱结核

脊柱结核是常见的脊柱感染性疾病，随病情进展可出现严重的脊柱和周围软组织破坏，甚至导致神经系统损伤，对患者的健康和生活产生严重的影响。目前，虽有学者对脊柱结核损伤的发病机制进行了大量研究，但尚没有确切的定论，多数学者认为可能与结核杆菌大量复制所造成的直接损伤和免疫介导等因素有关。Th17细胞是新发现的CD4辅助T细胞亚群，参与多种炎症感染及自身免疫疾病的组织损伤。研究表明，肺结核患者的胸水及外周血中可检测到IL-17 mRNA表达，且外周血IL-17的表达比正常对照组显著增高，组织细胞中有IL-17蛋白表达，组织中存在Th17细胞，提示Th17细胞亚群及其效应分子IL-17参与了结核的病理过程。本项目目的是初步探讨脊柱结核外周血中Th17细胞的数量变化及IL-17表达情况的分析，并寻求脊柱结核的治疗新靶点。

资料与方法

样本采集及处理：分别于术前及术后1周、1个月、6个月、12个月采集30例脊柱结核患者（年龄30～71岁）外周血标本，并按上述时间点采集30例健康者的外周血作为对照，每例抽取30 mL外周血，在血液标本中加入人淋巴细胞分层液后离心处理（室温，2 000 rpm，30 min），分离出外周血单核细胞及血浆，血浆于低温保存，待ELISA法检测IL-17。本研究经柳州市工人医院伦理委员会审批同意。

主要试剂及仪器：人细胞因子IL-17酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于上海酶联生物科技公司，PE-抗人CD4单克隆抗体、FITC-抗人IL-17单克隆抗体购于上海谷研科技有限公司，流式细胞仪为BD FACSCalibur flowcytomeler，软件为FCS ExpressV3。

流式细胞术检测外周血单核细胞中Thl7细胞比例：取外周血制成悬液，调整细胞密度至1×10/mL，接种于24孔板，加入PMA（50 ng/mL；Mdrich，St.Louis，MO）、离子霉素（1μg/mL）和莫能新（2μmol/mL），置于恒温箱（37℃，5%C02）培养6 h。加人PE-抗人CD4单克隆抗体10 μL，避光室温染色30min，以4%多聚甲醛固定，破膜剂破膜后加FITC-抗人IL-17单克隆抗体10μL，室温染色30 min，洗涤后重悬细胞，用流式细胞仪检测。

IL-17水平测量：取上述血浆用ELISA法测量IL-17含量，具体按照ELISA试剂盒（R&D Systems，Minneapolis，MN）说明书的方法进行，所有标本均双份测量，读取酶标仪450 nm处0D值。

统计学方法：采用SPSS 13.0分析，计量资料采用（x±s）表示，t检验，计数资料使用率（%）表示，x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一般资料比较：所有受试者均为汉族，30例脊柱结核患者中，男16例，女14例，年龄19～68岁，平均45.5岁；健康对照组中，男15例，女15例，年龄18～66岁，平均46.2岁。脊柱结核患者组与健康对照组在人种、年龄、性别方面相比差异无统计学意义（P>0.05）。

外周血单核细胞中Thl7细胞比例：流式细胞仪检测外周血单核细胞中CD4及IL-17均阳性的细胞为Th17细胞的比例。比较脊柱结核及健康者各个时期的Th17细胞比例：脊柱结核患者术前及术后1周、1个月、6个月、12个月的Th细胞比例分别为（9.2±0.9）%、（9.0±0.8）%、（4.2±0.3）%、（3.6±0.3）%、（2.1±0.2）%，健康者术前及1周、1个月、6个月、12个月的Th细胞比例分别为（1.8±0.2）%、（2.2±0.2）%、（2.4±0.3）%、（2.1±0.2）%、（1.9±0.1）%，脊柱结核组治疗前的Thl7细胞数量明显高于健康组（P<0.05），但结核组术后12个月的Th细胞数量较术前明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

血浆IL-17水平：ELISA法测量结果显示：脊柱结核患者术前及术后1周、1个月、6个月、12个月的IL-17水平为（70.25±6.35）ng/L、（68.15±7.50）ng/L、（53.28±6.55）ng/L、（32.45±5.52）ng/L、（31.75±4.65）ng/L，健康者术前及1周、1个月、6个月、12个月的IL-17分别为（34.36±4.38）ng/L、（41.15±4.55）ng/L、（43.56±5.85）ng/L、（40.12±6.45）ng/L、（38.66±6.15）ng/L，脊柱结核组治疗前的IL-17量明显高于健康组（P<0.05），结核组术后12个月的IL-17量较术前明显降低（P<0.05），见图2。

讨论

针对不同病原体的免疫应答免疫细胞会起不同的特化作用，CD4+T细胞可产生不同细胞因子，发挥特异性免疫应答作用，其中INF-7可活化巨噬细胞，杀灭留在巨噬细胞中的病原体。Th17细胞是CD4+T细胞中的一个亚群，因其分泌的IL-17细胞因子而得名。本研究检测脊柱结核外周血中Th17细胞比例，结果表明结核患者较健康者血液中Th17细胞显著增高，且手术治疗去除脊柱相关病灶后，外周血中Th细胞的含量会一定程度下降；同时通过ELISA法检测表明，脊柱结核患者血浆中IL-17水平也较健康者显著增高，表明Th17细胞及IL-17参与了脊柱结核的免疫应答，并在脊柱结核病灶的形成及病情发展中发挥了一定的作用。

研究表明，Th17细胞分泌的IL-17通过对中性粒细胞的趋化来杀灭細胞外的病原体。然而，结核杆菌是一种浸润细胞内的病原体，这种胞内菌IL-17的作用机制仍然不明，最近的研究表明IL-17能够增强患者对一些胞内病原体的免疫力，但远不如对胞外菌感染的抗菌效果明显，如感染亚致死量沙门氏菌的IL-17缺失鼠，其脾和肝中病菌量增加。本研究通过ELISA法检测发现，健康患者外周血中检测不到IL-17蛋白的高表达，但脊柱结核患者体内检测到大量的IL-17蛋白，且手术后时间越长的患者中外周血IL-17水平越较入院初期明显降低，提示脊柱结核患者外周血中可能存在记忆性的产生IL-17的细胞，这些细胞在感染结核后分泌IL-17。同时，血浆IL-17水平与Th17细胞在患者术前及术后数量变化趋势一致，提示血浆IL-17的表达增加与Th17细胞的比例增高相关。

本研究发现Th17细胞比例和IL-17水平在脊柱结核病灶清除术后都较入院初期降低，提示脊柱结核病灶的扩大可能与Th17细胞和IL-17介导的免疫应答有关。脊柱结核病灶被巨噬细胞吞噬，这种胞内结核菌的存在和增殖引发的宿主免疫反应是影响脊柱结核病灶扩大和转归的决定性因素。结核较为有特征性的病理改变为结核性肉芽肿，如干酪坏死组织中含有大量结核菌，可长期休眠。IL-17能通过中性粒细胞迁移到病灶周围来抗感染，从而发挥免疫保护作用，但过多的中性粒细胞也会引起脊柱结核病灶的扩大及形成冷脓肿。研究表明，在活动性结核患者体内中性粒细胞是最主要的受感染细胞类型，这些细胞也是结核杆菌长期潜伏的场所，在适宜的条件下能再度繁殖，造成病灶扩大或病情反复。

综上所述，Th17细胞和IL-17在脊柱结核患者体内的含量远高于健康者，且经手术治疗后，Th17细胞和IL-17含量在一定时期内会有所下降，表明Th17细胞和IL-17是介导脊柱结核病情发展及病灶扩大的重要免疫因素，因此，Th17细胞和IL-17是脊柱结核患者在细胞免疫治疗方面的一个新靶点。如何控制Th17细胞和IL-17在免疫保护及免疫破坏方面的平衡将为脊柱结核的防治方法提供新思路。endprint