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浒苔多糖对鸡免疫增强效果的研究

2018-02-10孙秋艳沈美艳朱明恩

动物医学进展 2018年1期
关键词:法氏囊滴度小肠

孙秋艳,沈美艳,朱明恩,李 舫

(山东畜牧兽医职业学院,山东潍坊 261061)

浒苔(Enteromorpha)俗称苔条、海苔,是绿藻石莼科中的水生藻类植物,浒苔多糖(Enteromorphapolysaccharide,EPS)是浒苔的关键活性成分[1],研究表明,浒苔多糖具有免疫调节的功能[2-4]。然而,EPS对鸡的免疫增强效果鲜有报道。为了探讨EPS对鸡的免疫增强效果,本试验首先给鸡注射不同含量的EPS,然后接种ND La Sota+IB H120二联弱毒疫苗,通过测定抗体滴度、sIgA含量、免疫器官指数、外周血中淋巴细胞比率、血清中IL-2和IFN-γ的含量来评价EPS免疫增强效果,为进一步开发EPS作为新型免疫增强剂应用于畜牧业生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和疫苗 IBV H120(infectious bronchitis H52)毒株,购自中国科学院微生物研究所。ND La Sota+IB H120二联弱毒疫苗,齐鲁动物保健品有限公司产品(生产批号:150252038)。

1.1.2 主要试剂 鸡新城疫病毒HI试验用抗原、阳性血清与阴性血清,青岛易邦生物工程有限公司产品(生产批号:150138082);鸡分泌型IgA(sIgA)ELISA试剂盒,上海美旋生物科技公司产品;IL-2 ELISA试剂盒、IFN-γ ELISA试剂盒,美国Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 浒苔多糖制备 新鲜浒苔8月份采自青岛海域,按照水煮醇沉法提取,分离纯化后EPS含量为69.2%,置-20℃保存,使用时按试验要求进行稀释。

1.2.2 动物处理 1日龄雄性SPF白羽鸡,购自山东济南SPAFAS鸡场,试验期间所用鸡均在山东畜牧兽医职业学院的SPF动物房严格按照SPF鸡饲养管理要求进行饲养。将192只1日龄SPF鸡随机分成4组,每组48只。Ⅰ~Ⅲ组在2日龄颈部皮下注射浒苔多糖,浒苔多糖含量分别为20、30、40 g/L,Ⅳ组注射生理盐水,剂量均为0.1 mL/只,连续3 d。各组于7、21 d分别点眼滴鼻1头羽份的新城疫-鸡传染性支气管炎(ND La Sota+IB H120株)二联弱毒疫苗。分别于免疫接种后7、14、21、28、35、42、49、56 d从每组随机抽取6只鸡,检测前禁食禁水6 h,进行相关指标检测。

1.2.3 血清中NDV和IBV抗体滴度的测定 无菌采集鸡心脏血2.0 mL注入离心管中,25℃、3 000 r/min离心20 min,取上清,采用中华人民共和国国家标准(GB/T 1655—2008)中的血凝抑制试验(HI)进行NDV抗体滴度的检测。采用中和试验(固定病毒稀释血清方法)进行IBV抗体滴度检测。记录结果均为n lg2。

1.2.4 小肠内sIgA含量的测定 剪取十二指肠至空肠段的鸡小肠10 cm,用无菌生理盐水将内容物冲洗干净,加3 mL含1 g/L牛血清白蛋白和蛋白酶抑制剂的PBS(pH7.2),室温下孵育5 h后匀浆,3 500 r/min离心10 min,取上清液备用,按照鸡分泌型IgA(sIgA)ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.2.5 免疫器官指数的测定 每组鸡称体重,取法氏囊、脾脏和胸腺,用无菌滤纸吸取表面水分后,分别称重,重量与体重之比即为免疫器官指数。

1.2.6 淋巴细胞比率的测定 用EDTA-Na真空无菌采血管采集鸡心脏血1 mL,用全自动血液分析仪测定血液内淋巴细胞比率。

1.2.7 血清中IL-2和IFN-γ含量的测定 无菌采集鸡心脏血2.0 mL注入离心管中,37℃静置1 h,4 000 r/min离心15 min,取上清,置-20℃保存备用,按照IL-2 ELISA试剂盒和IFN-γ ELISA试剂盒操作步骤进行IL-2和IFN-γ含量的测定。

2 结果

2.1 血清中NDV和IBV抗体滴度的变化

各组血清中NDV、IBV抗体滴度变化见表1和表2。结果显示,Ⅰ~Ⅲ组血清中NDV、IBV抗体滴度显著高于Ⅳ组(P<0.05);Ⅱ组血清中NDV、IBV抗体滴度极显著高于Ⅳ组(P<0.01),显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.05);Ⅲ组血清中NDV、IBV抗体滴度显著高于Ⅰ组(P<0.05);各组血清中NDV、IBV抗体滴度均在免疫后21 d达到高峰,28 d略有下降,然后迅速回升,49 d时抗体滴度达到最高水平,56 d开始下降,高水平抗体滴度维持时间较长。

2.2 小肠内sIgA含量的变化

各组小肠内sIgA含量变化结果显示,Ⅰ~Ⅲ组小肠内sIgA含量极显著高于Ⅳ组(P<0.01);Ⅱ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05);Ⅲ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ(P<0.05);各组小肠内sIgA含量均在免疫后21 d达到高峰,28 d略有下降,然后迅速回升,49 d时达到最高峰,56 d开始下降(图1)。

2.3 免疫器官指数的变化

各组免疫器官指数的变化结果显示,Ⅰ、Ⅲ组的胸腺、法氏囊指数显著高于Ⅳ组(P<0.05),脾脏指数极显著高于Ⅳ组(P<0.01);Ⅱ组胸腺、脾脏和法氏囊指数显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05);Ⅱ组各免疫器官指数均极显著高于Ⅳ组(P<0.01)(图2)。

2.4 淋巴细胞比率的变化

各组外周血淋巴细胞比率的变化结果显示,Ⅰ~Ⅲ组外周血淋巴细胞比率显著高于Ⅳ组(P<0.05);Ⅰ~Ⅲ组外周血淋巴细胞比率差异不显著(P>0.05)(图3)。

表1 血清中NDV抗体滴度的变化

注:Ⅰ~Ⅲ组为浒苔多糖试验组,浒苔多糖含量分别为20、30、40 g/L,分别用20 EPS、30 EPS、40EPS表示,Ⅳ为生理盐水对照组。同列角标相同字母表示差异不显著(P>0.05);不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Ⅰ~Ⅲ groups were EPS groups,the contents of EPS were 20,30,40 g/L respectively,20 EPS,30 EPS,40EPS were Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ groups,Ⅳ was normal saline control.The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and different small letters mean significant difference(P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

表2 血清中IBV抗体滴度的变化

注:Ⅰ~Ⅲ组为浒苔多糖试验组,浒苔多糖含量分别为20、30、40 g/L,分别用20 EPS、30 EPS、40EPS表示,Ⅳ为生理盐水对照组。同列角标相同字母表示差异不显著(P>0.05);不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Ⅰ~Ⅲ groups were EPS groups,the contents of EPS were 20,30,40 g/L respectively,20 EPS,30 EPS,40EPS were Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ groups,Ⅳ was normal saline control.The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and different small letters mean significant difference(P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

图1 小肠内sIgA含量的变化

2.5 外周血中IL-2含量的变化

各组外周血中IL-2含量的变化结果显示,Ⅰ~Ⅲ组外周血中IL-2含量极显著高于Ⅳ组(P<0.01);Ⅱ组外周血中IL-2含量显著高于Ⅰ组(P<0.05);Ⅰ~Ⅲ组外周血中IL-2含量差异不显著(P>0.05);所有组外周血中IL-2含量均在免疫后21 d达到高峰,28 d略有下降,然后迅速回升,49 d时抗体滴度达到最高水平,56 d开始下降(图4)。

2.6 外周血中IFN-γ含量的变化

各组外周血中IFN-γ含量的变化结果显示,Ⅰ~Ⅲ组外周血中IFN-γ含量极显著高于Ⅳ组(P<0.01);Ⅱ组外周血中IFN-γ含量显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05);所有组外周血中IFN-γ含量均在免疫后21 d达到高峰,28 d略有下降,然后迅速回升,49 d时抗体滴度达到最高水平,56 d开始下降(图5)。

3 讨论

机体血清抗体效价的变化能够准确、直观地反映体液免疫的状态[5],Ⅰ~Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组血清中NDV、IBV抗体滴度显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.05);Ⅱ组血清中NDV、IBV抗体滴度极显著高于Ⅳ组(P<0.01),显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.05),表明EPS可以显著提高血清抗体滴度。

法氏囊、胸腺和脾脏是鸡的主要免疫器官,这些免疫器官的发育状况及机能强弱直接决定禽类免疫水平[6]。本试验将鸡的法氏囊、胸腺和脾脏重量与体重之比作为免疫器官指数的指标进行研究,结果发现,Ⅰ~Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组的胸腺、法氏囊指数显著高于Ⅳ组(P<0.05),脾脏指数极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01);Ⅱ组胸腺、脾脏和法氏囊指数显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05),极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01),表明EPS对提高鸡免疫器官生长有一定程度促进作用。

A.胸腺;B.法氏囊;C.脾脏

A.Thymus;B.Bursa;C.Spleen

图2免疫器官指数的变化

Fig.2 Changes of immune organ indexes

图3 外周血中淋巴细胞比率变化

图4 外周血中IL-2含量的变化

图5 外周血中IFN-γ含量的变化

小肠sIgA 含量能够反映体液免疫的状态,本研究发现,Ⅰ~Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组小肠内sIgA含量极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01);Ⅱ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.05);Ⅲ组小肠内sIgA含量显著高于Ⅰ(P<0.05),表明EPS可以增强疫苗刺激机体产生sIgA的量。

淋巴细胞在机体的免疫应答中具有举足轻重的作用,是反映细胞免疫的直接指标[7]。本研究发现,Ⅰ~Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组外周血淋巴细胞比率显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.05),表明EPS对外周血淋巴细胞比率具有促进作用。

辅助T淋巴细胞(Th)是适应性免疫中非常重要的T淋巴细胞[8],能够释放促炎细胞因子。识别抗原后,激活的Th细胞根据功能和分泌细胞因子的差异可分为Th1、Th2细胞。Th1细胞能够分泌IL-2和IFN-γ,主要介导细胞免疫反应[9-10]。因此外周血中IL-2和IFN-γ的含量可以间接反映细胞免疫的状态。本研究发现,Ⅰ~Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)组外周血中IL-2、IFN-γ含量极显著高于Ⅳ(NS)组(P<0.01),表明EPS可提高外周血中IL-2、IFN-γ的含量。

综上说明,EPS对ND La Sota+IB H120二联弱毒疫苗免疫效果具有明显增强作用,可以增强鸡的免疫力,因此EPS可作为免疫增强剂进行开发。

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