伊维菌素微乳的研制及质量评价

朱庆贺，陈 曦，王丽坤，王 爽，骆宏伟，张 莹，金振华，史同瑞

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161005)

药物递药系统是医药界的热点研究领域之一。微乳(microemulsion，ME)是一种新型递药系统，该系统是由表面活性剂、辅助表面活性剂、油和水以适当的比例乳化而成的一种均匀、低黏度、热力学稳定的透明或半透明分散体系[1-2]。微乳是由英国化学家Schulman等于1943年首先提出的。自20世纪70年代以来，人们对微乳的微观结构、形成理论、理化性质进行了较为深入的研究，并将微乳应用于工业、日用化工业等领域。至20世纪90年代，人们又对微乳作为药物的递药系统进行了研究，并逐渐引起了人们的重视。虽然微乳与传统乳状液有着许多相似之处，但两者之间也存在着本质的区别。微乳是介于乳状液和胶团溶液之间的一种过度中间状态溶液，是一种热力学稳定的体系，制备时不需要强大的外力，可以长期贮存，且离心不分层。微乳具有极高的稳定性和对溶质的高度分散性及吸附能力；微乳作为难溶性药物的载体，具有加溶作用，使不溶或难溶性药物的溶解度显著升高，从而提高药物的生物利用度及机体的吸收速率[3-4]。

伊维菌素(ivermectin，IVM)具有广谱、高效、安全等优点，是一种广谱的抗寄生虫药物，对动物体内外寄生虫，尤其是线虫和节肢动物，具有高效驱杀作用。由于伊维菌素几乎不溶于水，因此，制约了伊维菌素的应用范围。目前，伊维菌素液体制剂主要有溶液剂、口服液、注射剂、乳剂、喷剂、透皮剂和浇泼剂等[5]。由于多数伊维菌素液体制剂均使用了大量的有机溶剂，且载药量低，临床用药量大，因而常引起用药部位发生炎症和坏死，影响了该类药物的使用效果。为克服现有弊端，本研究结合微乳制备技术，研究开发了50 mg/mL伊维菌素微乳剂，旨在方便伊维菌素的临床使用，提高其应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 伊维菌素，含量97.0%，武汉益华成科技发展有限公司产品；伊维菌素标准品，含量92.0%，中国食品药品检定研究院产品；蓖麻油，郑州智远化工产品有限公司产品；肉豆蔻酸异丙酯，上海高维实业有限公司产品；丙二醇、正丁醇、正戊醇，油酸、司班-80、吐温-80，天津市巴斯夫化工有限公司产品。

1.1.2 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；Winner802纳米粒度仪，济南微纳颗粒仪器股份有限公司产品；PXNDJ-2000型全自动运动黏度测定仪，上海轩澄仪器有限公司产品；ZNCL-S型恒温磁力搅拌器，上海羌强仪器设备有限公司产品；WD-A药物稳定性检查仪，天津药典标准仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 配方筛选与微乳剂制备 在单因素试验基础上，将筛选的表面活性剂、辅助表面活性剂按质量比(Km)1∶2、1∶3、1∶4比例混合，配制成混合表面活性剂，再将筛选的油相分别与各配比的混合表面活性剂按质量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例混匀。称取约一定量的伊维菌素分别加入，混匀溶解，在室温环境缓慢加入超纯水，并不断搅拌，观察各配方体系的性状变化，记录体系由浑浊变至澄清时的临界加水量。分别以油、表面活性剂和助表面活性剂作为三相，利用Origin 8.0绘制不同质量比值的伪三元相图，观察乳区的大小，确定配方中最适Km值、微乳界限及乳剂配方[6-8]。

1.2.2 物理特性测定

1.2.2.1 性状与pH 外观检查50 mg/mL伊维菌素微乳剂性状，用精密pH计测定pH。

1.2.2.2 黏度与粒度测定 应用全自动运动黏度计测定黏度。测试条件：温度25 ℃，黏度系数1.20，同条件下测定3次，测得50 mg/mL伊维菌素微乳剂的运动黏度，该温度下运动黏度和同温度下液体密度之积为其动力黏度。应用纳米粒度仪，测定微乳剂粒径大小及分布。

1.2.2.3 微乳类型鉴别 采用染色法[9]鉴别。取水溶性亚甲蓝染液和油溶性苏丹红染液，分别滴入50 mg/mL伊维菌素微乳剂中，轻轻摇晃，观察比较两种染液颜色在微乳剂中的扩散速度，判断乳剂类型。

1.2.3 药物含量检测方法建立

1.2.3.1 色谱条件 流动相为甲醇∶乙腈∶水=40∶55∶5；流速1.0 mL/min；检测波长244 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。

1.2.3.2 溶液配制 精密称取伊维菌素标准品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加流动相溶解后定容至刻度，制成200 μg/mL的储备溶液, 精密量取储备液5.0 mL, 置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，配置成100 μg/mL的标准对照品溶液。

精密量取伊维菌素微乳相当于伊维菌素10 mg，置于100 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，超声30 min，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，制成供试品溶液，进样测定。精密量取与供试品等量的空白乳剂，按照供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

1.2.3.3 方法专属性考察 取伊维菌素标准溶液、伊维菌素微乳供试品溶液、空白基质溶液用流动相按一定比例稀释后，分别进样20 μL，测定成分峰值，记录色谱图。

1.2.3.4 标准曲线绘制 精密量取对照品储备液1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL分别置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，配置成浓度分别为20、60、100 、160 、200 μg/mL的系列对照品溶液。按1.2.3.1项下色谱条件测定，以峰面积(y)对利福昔明的浓度(x，μg/mL)进行线性回归方程。

1.2.3.5 稳定性试验 取浓度为100.0 μg/mL的标准溶液，避光保存，于0、2、4、6、8、12 h后进样20 μL，分别测定峰面积并代入标准曲线方程，计算实测浓度，并计算得其RSD。

1.2.3.6 回收率试验 分别精密取适量储备液并添加配方剂量的空白微乳，超声溶解后用流动相稀释成低(L=60 μg/mL )、中(M=100 μg/mL)、高(H=160 μg/mL)3种理论浓度的溶液，每个浓度配制3份，分别测定其含量，计算其回收率。

1.2.3.7 样品含量测定 按照1.2.3.2项下供试品溶液制备方法处理样品，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，按外标法计算得样品中伊维菌素的含量。

1.2.4 稳定性评价

1.2.4.1 离心、灭菌、冷冻试验 取50 mg/mL伊维菌素微乳剂，加入离心管中，以10 000 r/min转速离心30 min；置高压灭菌器内，在121℃条件下高压灭菌30 min；在-20 ℃环境贮存7 d～10 d，取出置室温环境，分别观察50 mg/mL伊维菌素微乳剂性状。

1.2.4.2 光照试验 取50 mg/mL伊维菌素微乳剂样品3批，在光照度4 500 lx±500 lx条件下放置10 d，观察微乳剂性状，测定pH，以及黏度、粒度及伊维菌素含量。

1.2.4.3 加速试验 取50 mg/mL伊维菌素微乳剂样品3批，置温度40℃±2℃环境中放置6个月，每月取样，观察微乳剂性状，测定伊维菌素含量。

1.2.4.4 长期试验 取50 mg/mL伊维菌素微乳剂样品3批，置室温环境中放置24个月，分别在0、3、6、9、12、18、24个月取样检测，观察微乳剂性状，测定伊维菌素含量。

2 结果

2.1 配方筛选结果

根据伪三元相图筛选结果，当表面活性剂与辅助表面活性剂的质量比为1∶4时，形成的微乳乳区面积最大，因此，选择微乳区大、稳定性好的各组分配比作为微乳剂配方(图1)。筛选的50 mg/mL伊维菌素微乳剂各组分配比为伊维菌素5%、油6.79%、乳化剂13.58%、辅助乳化剂54.27%、超纯水20.36%。

图1 不同乳剂体系的伪三元相图

2.2 乳剂物理特性

外观50 mg/mL伊维菌素微乳剂为淡黄色、油状透明液体，微乳剂pH为6.27～6.32，运动黏度为610.50 mm2/s，动力黏度为714.28 mPa·s，乳滴粒径主要分布在1 nm～10 nm范围内，平均粒径为6.30 nm(图2)。微乳剂类型鉴别结果表明，水溶性亚甲蓝染液扩散速度较快，由此判定50 mg/mL伊维菌素微乳剂为O/W型乳剂。

2.3 伊维菌素含量检测方法

2.3.1 方法专属性考察 分别测定伊维菌素标准溶液、伊维菌素微乳供试品溶液、空白基质溶液的峰面积。如图3所示，供试品溶液和标准溶液保留时间一致，约5.3 min，组方中的辅料在此时无吸收，所以不干扰伊维菌素含量的测定。

2.3.2 标准曲线绘制 依据试验结果，得回归方程y=33 962x+26 173，R2=0.999。试验表明，伊维菌素浓度在20.0 μg/mL～200.0 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

图2 50 mg/mL伊维菌素微乳剂粒径分布曲线图

2.3.3 稳定性试验 分别测定0、2、4、6、8、12 h标准品溶液峰面积并代入标准曲线方程，计算实测浓度，得其RSD=1.3%(表1)。

2.3.4 回收率试验 分别测定高、中、低三种浓度标准溶液含量，计算得其平均回收率为98.37%～101.70%(表2)。

图3 伊维菌素HPLC色谱图

2.4 微乳剂稳定性

50 mg/mL伊维菌素微乳剂经10 000 r/min离心30 min，未见分层、析出等异常现象。在121℃高压灭菌30 min及冷冻保存后，外观性状均未见异常变化。光照试验结果表明，微乳剂在光照度4 500 lx±500 lx条件下放置10 d，其pH、平均粒径、运动黏度、动力黏度、药物含量均未见明显变化(表3)。加速试验和长期试验结果表明，微乳剂外观性状均未见变化，药物含量均在正常范围内，符合药物质量规定(表4和表5)。

表1 稳定性试验结果

表2 回收率试验结果

表3 伊维菌素微乳剂光照试验结果

表4 加速试验中伊维菌素的含量测定结果

表5 长期试验中伊维菌素的含量测定结果

3 讨论

在制备微乳剂时，确定油相和乳化剂的种类及配比是决定乳剂稳定性的关键因素。本试验首先依据伊维菌素在不同油相中的溶解度，选择溶解度高的油相作为初选油相，然后依据亲水亲油平衡值(HLB)，选择表面活性剂。根据油相对制备O/W型微乳所需的HLB值，以及O/W型微乳需用HLB值为8～18范围的表面活性剂，筛选适宜的表面活性剂和辅助表面活性剂。在确定了表面活性剂、辅助表面活性剂和油相后，通过相图选择较大微乳区的各组分配比，并确定微乳剂配方。试验证实，本试验筛选配方制备的微乳剂性状稳定。

在确定合适的微乳配方后，微乳的制备工艺较为简单。在制备伊维菌素微乳剂时，环境温度、搅拌速度和时间对微乳剂制备的影响均不明显，这与丁丹等[10]报道结果一致。笔者认为，制备稳定微乳的关键是筛选适宜的配方，除此之外，原材料的质量，以及各组分加入后搅拌的均匀度与乳剂质量具有明显关联性。本制备试验表明，如果原材料质量较差，或者搅拌不均匀，虽然在制备空白乳剂时也能形成微乳，但微乳对药物的溶解性降低，微乳剂经高压灭菌后出现分层，但摇匀后也能恢复原状。

粒径是衡量微乳形成与否的标准，粒径分布是评价微乳稳定性的重要指标。经纳米粒度仪测定，本试验制备的微乳剂平均粒径为6.30 nm，符合微乳粒径均在100 nm以下范围。微乳的显著增溶效果与其高分散性有关，O/W型微乳剂可有效提高药物的溶解度[11-12]。本试验证实，与常规10 mg/mL伊维菌素注射液制备工艺比较，微乳剂不仅可明显提高伊维菌素的溶解度，而且还简化了生产工艺，降低了生产成本。本研究采用HPLC法测定伊维菌素含量，直接用流动稀释、定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样，结果表明，微乳剂中其他辅料对伊维菌素的测定无干扰，试验说明，该方法简便易行，灵敏度高，重现性好。

目前，刘根新等[13]制备了50 mg/mL伊维菌素O/W型纳米乳注射液，汤佳莘等[14]研制了含0.3 mg/mL伊维菌素和50 mg/mL吡喹酮复方纳米乳，丁丹等[10]研制了20 mg/mL伊维菌素O/W型纳米乳透皮剂。兰州畜牧与兽药研究所研制了含水80%的伊维菌素微乳[15]。本试验研制的50 mg/mL伊维菌素微乳剂含水量为20.36%，虽然提高含水量也可制备同浓度的伊维菌素乳剂或亚微乳剂，但外观呈半透明状态，总体质量评价劣于含水20.36%的微乳剂，因此，筛选确定了本试验配方，且该配方制备工艺简便，质量优良，易于实现产业化。

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