西北民族大学榆中校区8种草本科植物根际产功能酶放线菌的筛选

车敏娜，吴 恒，武中庸，热孜万古力·赛买提，王国威，郑棱峻，陈士恩

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)

包括蛋白酶、淀粉酶、脂酶等在内的功能酶在生命科学、医学科学领域以及食品、饲料添加剂、化工等行业具有潜在的应用价值。工业生产一般是在特殊的物理化学条件下进行的，而在这个过程中起重要作用的酶制剂需要合适的反应条件才能达到最佳酶活，然而通常情况下这种最佳反应条件很难达到[1]。因此寻找能够适应特殊环境条件的酶制剂是关键。放线菌是一类能够产生多种生物活性物质的微生物资源，如酶、抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、生物碱等均由其产生。

植物根际是指生物和物理特性受到植物根系影响的紧密环绕根部的区域。在植物根际区域内生长的微生物称为根际微生物。据报道，根际区域微生物要比非根际区域微生物多19～32倍，根际放线菌产生抗菌物质和其他生理活性物质的比例也显著高于根际周围土壤来源的放线菌[2]。因此，植物根际微生物是一类值得深入研究与开发的微生物资源，从根际微生物的代谢产物中寻找各种生物活性物质是改善工业生产条件的又一重要途径。

西北民族大学榆中校区位于甘肃省中部、省会兰州东郊的榆中县，榆中县地处103°49′15″～104°34′40″E，35°34′20″～36°26′30″N。榆中县内地层发育不全，缺失整个古生界和中生界的三叠系。县境内的侵入岩为前古生代和早古生代晚期的酸性岩浆，其地质构造极其复杂。目前，还没有针对我国西北民族大学榆中校区草本科植物根际放线菌资源的相关研究报道，本文采用了稀有放线菌资源选择性分离方法，对采自西北民族大学榆中校区不同海拔梯度、不同植被类型的不同草本科植物根系土壤放线菌进行分离，并对所得菌株做了部分生理活性测定，对功能酶产生菌做了筛选。

1 材料与方法

1.1 土样来源及处理

2016年7月下旬从西北民族大学榆中校区以及周边选取8个不同植被类型、不同海拔梯度(海拔1 800～2 500 m)的样区，采集到8份具有代表性的植物的根际土(0～20 cm)，各约100 g，分装于自封袋中，贴上标签后带回榆中校区实验室保存，以供分离放线菌之用。土样概况及草本科植物的概况见表1。

表1 土样的类型和采集地概况

1.2 菌种分离

1.2.1 分离培养基

菌种分离采用甘油精氨酸琼脂分离培养基，其中含精氨酸2 g，NaCl 50 g，甘油12.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.000 1 g，CuSO4·5H2O 0.000 1 g，K2HPO41 g，ZnSO4·7H2O 0.000 1 g，蒸馏水 1 L，琼脂20 g。调节pH值至8.0以上，121 ℃灭菌30 min。

在分离培养基中加入抑制剂可以有效抑制细菌和真菌的生长，抑菌剂配方：放线菌酮40 μg·mL-1,重铬酸钾75 μg·mL-1,青霉素2 μg·mL-1。

1.2.2 分离方法

取3 g土样样品，在120 ℃干热条件下处理，1 h后用27 mL 6%酵母提取物溶液和270 μL 5% SDS溶液的混合液作为土样提取液。采用稀释涂布平板法进行分离，计数、纯化、保藏用常规方法。

1.3 代谢产物测定

1.3.1 MR实验

采用的培养基含蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO45 g，蒸馏水1 L，调整pH值至7.2,121 ℃灭菌20 min。甲基红试剂由甲基红0.1 g,95%乙醇300 mL,蒸馏水200 mL混合而成。将实验菌接培养基中，2个重复，置22 ℃培养箱2～6 d，在培养液中加入一滴甲基红试剂，阳性反应表现为红色(pH 值4.4)，阴性则为黄色(pH值6.0)。

1.3.2 硫化氢的产生

采用柴斯纳培养基，含蛋白胨10 g，柠檬酸铁0.5 g，蒸馏水1 L，pH值7.2,121 ℃灭菌20 min。将实验菌种接种于柴斯纳培养基上培养，观察2周后，产生的黑色素即为硫化氢。

1.4 功能酶产生菌的筛选

1.4.1 色氨酸酶

培养基为1%胰胨水溶液，调pH值至7.2～7.6，分装1/4～1/3试管，于115 ℃灭菌30 min。所用试剂为对二甲基氨基苯甲醛8 g, 95%乙醇760 mL,浓HCl 160 mL。

挑取实验菌接种于液体培养基中，每次2个重复，置22 ℃培养4、7 d，沿管壁缓缓加入3～5 mm高的试剂于培养液表面，阳性表现为液层界面为红色，若此时颜色不明显，可在培养液中加入4～5滴乙醚，轻轻摇动，使乙醚充分分散于液体中，静置片刻后继续添加试剂。

1.4.2 过氧化氢酶

挑取实验菌株于干净的玻片上，滴加3～4滴3%～10%过氧化氢溶液，观察结果。阳性表现为0.5 min内产生大量气泡，反之为阴性。

1.4.3 脲酶

采用培养基含蛋白胨1 g，NaCl 5 g，KH2PO42 g，酚红0.012 g，葡萄糖1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，pH值 6.8～6.9(微黄)，于121 ℃灭菌20 min。待培养基冷却至55 ℃时加入无菌尿素，使尿素终浓度为2%。将实验菌株接种于培养基中，22 ℃培养4 d，观察培养基的颜色。

1.4.4 脂酶

采用培养基含蛋白胨1 g，NaCl 5 g，CaCl2·7H2O 0.1 g，琼脂9 g，蒸馏水1 L，pH值7.4，121 ℃灭菌20 min。待基础培养基冷却至40～50 ℃时，分别加入吐温-20、吐温-40、吐温-80三种无菌吐温至终浓度为1%，倒平板。划线接种实验菌于平板，培养1～2周，每天观察。阳性表现为生长的周围有模糊晕圈，否则为阴性。

1.4.5 蛋白酶

采用培养基含蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，明胶200 g，蒸馏水1 L，pH值7.4，于121 ℃灭菌20 min。将实验菌接种于明胶培养基表面，22 ℃培养一周，观察其液化程度。

1.4.6 淀粉酶

采用淀粉水解培养基，含可溶性淀粉10 g，K2HPO40.3 g，MgCO21 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 值7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。碘液由碘片1 g,碘化钾2 g,蒸馏水300 mL制备而成。采用点接法接种实验菌于淀粉培养基，培养2周，待菌生长良好时，在菌落周围滴加碘液，观察是否有透明圈形成。

1.4.7 纤维素酶

采用纤维素水解培养基，含MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31 g，蒸馏水1 L，pH值 7.2，121 ℃灭菌30 min。将滤纸条一端接种于液体培养基中，灭菌后将实验菌接种在液面以上的滤纸条上，一个月后观察滤纸条是否被分解。

2 结果与分析

2.1 代谢产物

表2表明，有2株菌QL04和QL08产H2S，18株放线菌在糖代谢过程中均无有机酸产生。

2.2 功能酶产生菌

继续对这18株形态各异的放线菌做功能酶菌株筛选，检测结果如表3所示，发现18株放线菌中有9株放线菌产淀粉酶，16株产蛋白酶，16株产脲酶，18株产过氧化氢酶，12株产聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯酶，14株产聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯酶，7株产聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯酶，1株产色氨酸酶，3株产纤维素酶。

表2 代谢产物测定结果

注：+，阳性;-，阴性。同表3。

表3 功能酶产生菌筛选结果

3 讨论

放线菌丰富的次级代谢产物作为工业、农业、食品、医药等行业的重要资源之一，一直备受国内外学者的关注。随着放线菌菌种分离、纯化、培养、鉴定等技术的发展，定会挖掘出更多的放线菌新种属，发现更多的结构新颖、用途广泛的次级代谢产物。随着各项分析技术的逐渐进步，微生物与植物之间相关的各类信号分子及其功能的挖掘已经

成为目前研究的热点[3]。在根际这个特殊的生态系统中,根际微生物可以通过根际产生生长素、赤霉素或激动素类物质影响植物生长。以往有关根际微生物-植物间互作的研究多集中在细菌和真菌，本文选取了西北民族大学榆中校区8种草本科植物根际土作为放线菌的分离源，放线菌与草本科植物间的互作[4]可能会对放线菌的生理产生一定的影响，有待今后做进一步深入的研究。

[1] 司美茹,薛泉宏,来航线.放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究[J].微生物学通报,2004,31(2):61-65.

[2] 袁丽杰，章广玲，张玉琴，等. 草本科植物根际放线菌的种群多样性及生物活性初步研究[J].中国抗生素杂志，2009,34(8):463-466.

[3] 沈仁芳,孙波,施卫明,等. 地上-地下生物协同调控与养分高效利用[J].中国科学院院刊,2017,32(6):566-574.

[4] 陈伊,李舟,魏玉珍,等.根际放线菌I06203431产生的核苷类抗生素3431的研究[J].生物学杂志，2009，26(4)：17-20.