甜瓜链格孢叶斑病的2种抗性接种鉴定方法比较

姚协丰，李苹芳，朱凌丽，徐锦华，张 曼，任润生，刘 广，侯 茜，羊杏平

(江苏省农业科学院蔬菜研究所 江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014)

甜瓜(CucumismeloL.)是一种重要的葫芦科作物，世界前八大水果之一。我国甜瓜种植面积和产量分别占世界总量的45%和55%以上，因其经济效益显著，在设施农业生产中占有重要地位[1]。葫芦科链格孢叶斑病(Alternariaalternata(Fr.) Keissler)，又称叶枯病，危害植物叶片、茎蔓和果实等部位，田间以叶片发病为主[2]。研究表明，链格孢叶斑病发病范围广，涉及葫芦科多种作物，如黄瓜、西瓜、南瓜、甜瓜、西葫芦、苦瓜、丝瓜、瓠瓜、冬瓜等主要瓜类作物。以甜瓜为例，近年来在新疆、上海、北京、甘肃等地甜瓜作物均发生严重的链格孢叶斑病，由于发病后的植株叶片干枯死亡，对甜瓜生产造成严重的影响[2-5]。前期我们对江苏南京地区甜瓜叶斑病进行初步调查发现，南京地区甜瓜生产区域有典型的甜瓜链格孢叶斑病症状病株，田间发病率达到30%，危害严重。

生产上化学防治是叶部病害最主要的防治方法，但长期使用化学农药极易使病原菌产生抗性，且对环境与人类身体健康均危害很大[6]。因此选育抗病品种是防治链格孢叶斑病最根本、最有效的方法。但是目前国内尚未有系统开展甜瓜抗链格孢叶斑病抗性的研究。为此，建立可靠的链格孢叶斑病鉴定方法，进行甜瓜种质资源对链格孢叶斑病抗性的评价，对于选育链格孢叶斑病抗性品种，从而克服或减轻链格孢叶斑病的危害，具有重要的实践指导价值。本研究比较了活体接种与离体接种2种不同链格孢叶斑病菌的接种方法，通过对20份甜瓜种质资源进行接种鉴定，建立了稳定可靠的链格孢叶斑病菌离体鉴定体系，2种方法同时筛选出5份具有中等抗性的甜瓜抗性资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2016年3—4月期间在江苏省农业科学院蔬菜研究所玻璃温室进行，3月23日播种，4月20日接种，每个材料接种16株，同时取样第3片真叶作为待检测用的离体叶片，共取9片，4月26日、4月28日、4月29日统计病情。接种所用链格孢叶斑病菌[Alternariaalternata(Fr.) Keissler]菌株由江苏省农业科学院蔬菜研究瓜类实验室前期在田间病株收集、分离和致病性鉴定，因链格孢叶斑病菌株AlternariaalternateLH1601致病力强且稳定性好，作为抗病性接种鉴定菌株。育苗基质采用品氏进口育苗基质，灭菌处理后备用。

供试20份甜瓜材料由江苏省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究室自己选育并保存，材料名称和来源见表1。

表1 供试甜瓜材料及来源

1.2 链格孢叶斑病菌培养及产孢

链格孢叶斑病菌分生孢子产孢方法。挑取LH1601的纯性培养物接种于PDA固体培养基(20%土豆，2%葡萄糖，1.5%琼脂)，置于26～28 ℃培养箱内进行培养。选取新鲜完整的甜瓜叶片，经灭菌蒸馏水冲洗干净后，再用75%酒精擦拭表面并晾干备用。用直径0.7 cm的灭菌打孔器切取上述新鲜培养1周的菌块，倒置于叶片正面，于28 ℃下培养。5～7 d后用刀片取下菌块所在叶片，于研钵中研磨，并经4层纱布过滤。滤液即为分生孢子液，显微镜下用血小球计数板计数并稀释成5×105孢子·mL-1的孢子悬浮液用于喷雾接种。

1.3 室外苗期活体接种

参照Zhang等[7]的接种方法，在甜瓜长至3～4片真叶时，在植株正反面喷施预先配制好的5×105孢子·mL-1孢子悬浮液(含1% Tween 80)，直至叶片滴水为止。前3 d搭塑料拱棚保湿，保持相对湿度90%以上，3 d后揭开小拱棚，7、10 d调查统计病情。

叶片病级分级。0级为无可见病斑，1级为有疑似病斑，2级为病斑面积<10%，3级为10%≤叶斑面积<25%，4级为25%<叶片坏死面积≤50%，5级为叶片坏死面积>50%。

根据平均病情级别数(RI)确定链格孢叶斑病抗性级别。高抗(HR)，RI<1.0；抗(R)，1.0≤RI<2.0；中抗(MR)，2.0≤RI<3.0；感病(S)，3.0≤RI<4.0；高感(HS)，RI≥4.0。

平均病情级别数计算公式：

RI=Σ(级值×株数)/总株数[6-7]。

1.4 离体叶片菌丝块接种

离体叶片菌丝块接种方法参照Wang等[8]方法稍做修改，取4 ℃冰箱保存的LH1601的纯性培养物接种于PDA固体培养基，于26～28 ℃培养1周。取健康甜瓜植株第3～4片真叶，经灭菌蒸馏水冲洗干净，晾干后置于垫有无菌滤纸的培养皿中，叶片正面朝上。用0.5 cm的打孔器切取菌丝块，正面朝下置于甜瓜叶片上，每张叶片左右两边各接1个菌丝块。培养皿放在温度(26±1)℃，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度约90%的光照培养箱中培养。每处理3张叶片，重复3次，5 d后测量菌丝块周围的菌丝侵染扩展半径。

1.5 统计分析

采用SAS8.0统计软件对试验数据进行方差分析。离体叶片菌丝块接种的菌丝侵染扩展半径与活体接种鉴定后RI的相关性采用皮尔逊(Pearson)相关性分析方法(P≤0.05水平)。

2 结果与分析

2.1 不同甜瓜材料苗期活体接种鉴定抗病性

采用喷雾接种方法对20份甜瓜材料进行链格孢叶斑病菌的室外活体接菌实验，供试20个甜瓜材料接种4～7 d后均开始发病，叶部出现链格孢叶斑病典型症状，即叶片出现黄色小斑点，病斑性状不规则，后期病斑逐渐扩大，呈退绿褐色病斑(图1)。不同材料间发病程度轻重有所不同，但未发现免疫材料，未接种对照均未发病。

图1 苗期活体叶片接种甜瓜链格孢叶斑病发病情况

由表2和3可知，5份甜瓜材料发病相对较轻，表现为中抗，其RI在2～3，占总数的25%；表现感病的材料有5份，RI在3.6～3.9，占总数的25%；其余材料均表现为高感，平均病情级别数均≥4，表现对链格孢叶斑病较为敏感。

2.2 离体叶片菌丝块接种鉴定不同甜瓜材料链格孢叶斑病抗性

表2 不同甜瓜材料苗期对链格孢叶斑病抗性鉴定结果

注：同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P≤0.05)。

表3 甜瓜材料对链格孢叶斑病的抗性评价

将大小一致的菌丝块接种于新鲜甜瓜叶片，观察菌丝块扩展反应，5 d后测量菌丝块周围的菌丝侵染扩展半径。如图2所示，所选20份材料接种链格孢菌丝块后周围均有菌丝侵染生长。测量发现半径从1.50～4.75 cm不等，各材料间菌丝侵染扩展范围大小差异显著。如表2所示，其中5份材料侵染扩展半径≤2 cm，表现为中抗；5份甜瓜材料扩展半径均>2 cm，表现为感病；其他10份甜瓜材料扩展半径≥4 cm，表现为高感。

图2 苗期离体叶片接种甜瓜链格孢叶斑病发病情况

2.3 离体叶片菌丝块接种与苗期活体接种鉴定比较相关性分析

为揭示离体叶片菌丝块接种方法是否可替代活体接种法，采用SAS8.0统计软件对试验数据进行皮尔逊相关性分析。表2结果显示，菌丝侵染扩展半径与活体接种鉴定后RI呈显著相关，扩展半径与RI的相关系数达0.91。由此可见，离体叶片菌丝块接种方法是稳定可靠的。

3 讨论

离体叶片接种法，一方面可以大大缩短抗性鉴定周期、提高抗性鉴定的效率，另一方面操作简单、环境因素可控，重复率高；此外，此方法具有不影响筛选材料进一步生长的优点，抗性材料可以继续用于其他用途[9]。所以目前离体叶片接种法已经被广泛应用于植物真菌病害如蔓枯病的品种抗性鉴定中[10-11]，但链格孢叶斑病菌离体叶片鉴定还未有报道。本研究通过采用室内离体叶片和室外苗期接种2种不同的接种方法对20份甜瓜材料进行了链格孢叶斑病抗性鉴定，研究结果显示，离体叶片鉴定结果与室外苗期活体接种结果一致，即菌丝侵染扩展半径可用于判断供试甜瓜材料对链格孢叶斑病敏感性。2种方法筛选出相同的5份甜瓜材料具有中等抗性，相关性达到0.91(P≤0.05)。因此，本研究建立了一种简单、有效且容易重复的甜瓜叶部病害链格孢叶斑病鉴定方法。

本研究所采用的20份甜瓜材料均不同程度感染链格孢叶斑病，未发现对链格孢叶斑病菌免疫的资源。其中5份材料对链格孢叶斑病菌有一定抗病性，根据RI判断达到中抗水平。这5份材料中2份为高代自交系，分别为MM-2(菜瓜高代自交系)，MM-3(新疆甜瓜高代自交系)，另3份材料为新组合。这2个高代自交系可望作为下一步育种亲本材料。由于所选材料有限，为发现更多优异抗性资源，需加大种质资源数量，挖掘蕴藏潜在有价值的抗性基因资源，用于抗链格孢叶斑病菌甜瓜品种的选育和遗传改良。

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