针药诱导骨髓间充质干细胞分化的研究进展※

符梦彬 陈恒伟 张玉溪 魏江艳 黎小侨 张 敏 赵 晶 刘英莲 孙 曌

（海南医学院中医学院，海南 海口 570100）

骨髓间充质干细胞（bone messenchymal stem cells，BMSCs）是一种来源于骨髓的具有多向分化潜能的原始细胞，近年来成为研究的热点。在一定条件下BMSCs能分化成为软骨细胞，神经元样细胞，成骨细胞，心肌细胞等，且具有来源充足，取材方便，使用安全等特点[1]。许多研究表明针刺和中药可能影响BMSCs的分化方向，本文通过分析文献着重对针刺和中药诱导骨髓间充质干细胞分化的研究进行综述。

1 针药诱导BMSCs分化为软骨细胞

创伤和骨关节炎常常导致关节软骨的退变，关节软骨缺乏血管和神经，自身修复能力有限。研究发现在特定的条件下，能够诱导BMSCs分化为软骨细胞[2]。软骨主要有胶原纤维和蛋白聚糖构成，而软骨细胞的主要功能是分泌胶原蛋白的酸性黏多糖[3]，其中Ⅱ型胶原占大部分，它和糖胺聚糖是软骨细胞的特征性标志[4]。

周信[5]采用针药结合诱导大鼠BMSCs向软骨细胞分化，通过分组实验发现，针刺血清配合复方丹参注射液能有效促进BMSCs增殖和诱导其向软骨细胞分化，但是单独使用针刺血清并没有这种作用。电针治疗兔膝关节炎可见软骨层增厚，细胞重排，延长治疗时间可促使软骨修复[6]。

张清林等[7]用TGF-β1、BMP-2联合诱导BMSCs向软骨细胞分化，细胞由长梭形变为多角形，分泌糖胺聚糖，有Ⅱ型胶原表达，说明该2种细胞因子均可单独诱导BMSCs向软骨细胞分化。黄荷等[8]采用淫羊藿甙体外诱导因骨关节炎行全髋关节置换手术的病人骨髓向软骨细胞分化，糖胺聚糖含量丰富，Ⅱ型胶原含量多，淫羊藿甙可诱导hMSCs向软骨细胞分化。马笃军等[9]则是用牛膝醇提物体外诱导兔BMSCs向软骨细胞分化，Ⅱ型胶原荧光染色阳性明显。牛膝性味平和，适于各种体质患者，适于长期服用；有明显的引经作用，适于软骨损伤的高发部位——膝关节；能标本兼顾，适于OA的各种类型；能同时治疗多种中老年人常见病，适于OA的高发人群；药物来源广、价格低廉。汤治黎等[10]将大鼠BMSCs加入高糖DMEM培养液（含0.5%的复方丹参注射液、10%胎牛血清）诱导其向软骨细胞分化，各组Ⅱ型胶原的阳性率呈弱阳性，表明丹参对大鼠BMSCs具有定向诱导作用和辅助改善作用。修忠标等[11]以鹿茸多肽体外诱导第3代兔BMSCs向软骨表型分化，糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多，表明鹿茸多肽对BMSCs定向软骨分化有明显促进作用。

2 针药诱导BMSCs分化为心肌细胞

目前，心脏疾病发病率呈逐年上升趋势，严重威胁人类的生命健康，围绕心血管疾病防治机制及相关药物的研究越来越深入，体外培养心肌细胞既能保持原有结构及功能特点，又能排除神经-体液等因素影响，是一种较为理想的体外试验方法[12]。心肌细胞呈短圆柱形，有分支，细胞核位于细胞中央，一般只有一个。检测到有肌管的形成并表现出收缩特性；有窦房结样和纤维细胞生长因子（bFGF），心肌特异性蛋白T（cTnT）、连接蛋白（Connexin43） 和α-肌动蛋白等心肌细胞特殊的表达标志，才能证实BMSCs向心肌细胞的分化[13]。

针刺手厥阴心包经对PKC表达、钙超载均有抑制作用，而且通过心脑通络液预处理、针刺后处理可减轻缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡，能够降低再灌注损伤程度，对心肌有良好的保护作用[14-16]。李记泉等[17]证实了针刺手厥阴心包经内关穴保护缺血心肌具有循经特异性，内关穴和列缺穴可逆转KChIP2 mRNA表达的下调，但内关穴较列缺穴疗效显著。电针内关穴还可以使失血性低血压大鼠血压显著升高、心肌细胞PKA含量发生明显变化[18]。

黄芪是用于防治心脑血管疾病的传统中药，黄芪甲苷是从黄芪中分离提纯的一种皂苷，具有良好的强心作用，对缺血心肌细胞具有保护作用，能有效保护缺氧的心肌细胞，降低损伤程度，且对心肌肥大具有抑制作用。近年来不乏学者研究黄芪诱导BMSCs成为心肌细胞。赵静苗等[19]和冼绍祥等[20]皆采用黄芪甲苷体外诱导BMSCs成为心肌细胞，诱导后细胞呈梭形，并出现肌管；BMSCs表面抗原CD44表达阳性， BMSCs不仅表达心肌特异性蛋白Desmin和cTnI，而且表达成熟的心肌特异性蛋白α-MHC和β-MHC。宋雪云等[21]在黄芪甲苷的基础上联合丹参酮IIa诱导BMSCs向心肌样细胞分化。各组均表达肌钙蛋白T，尤其丹参酮IIa和黄芪甲苷联合组高于单一药物组，说明两者联合诱导效果优于单一成分，体现了中药配伍多因多效多靶点的效应。除黄芪外，还有王新华等[22]用地黄低聚糖诱导BMSCs向心肌样细胞分化，地黄低聚糖诱导后BMSCs细胞裂解液中cTnI、CK和CK-MB水平升高，与5-氮胞苷联合应用后其诱导BMSCs内心肌特异性物质表达的作用较单药更强。张金生等[23]在体外模拟心肌微环境的条件下使用益气活血化瘀方药诱导BMSCs向心肌样细胞分化，实验结果表明活血化瘀法与益气活血法、益气法均有促进BMSCs中的CD105阳性细胞分裂并向心肌样细胞分化的作用，其中活血化瘀法效果最为明显。

3 针药诱导BMSCs分化为神经元样细胞

临床上常选用BMSCs作为种子细胞来治疗缺血性脑疾病、帕金森病和脊髓损伤等神经系统疾病。1999年Kopen等[24]在对MSCs移植给正常新生小鼠的研究表明MSCs具有多向分化的潜能，不但分化为成熟的星形胶质细胞，而且分化为神经元，对于中枢神经系统疾病如脑缺血具有广阔的治疗前景。BMSCs对损伤脑的环境变化比较敏感，与缺血脑组织共培养的细胞可以产生BDNF、NGF、VEGF、HGF等神经营养因子和血管生长因子，BMSCs能够提高神经营养因子表达也有可能是缺血脑卒中功能恢复的关键趋势。

针刺在促进诱导神经元细胞的修复与再生已有一定的研究基础，对内源性NSC的增殖活化，并定向分化形成新生的神经元。如“醒脑开窍”针法[25]可促进脑梗死神经功能恢复，通过诱导保护性基因表达，增强相关生长蛋白表达，促进神经网络重建发挥促神经元重塑作用。针刺能促进骨髓间充质干细胞迁移和分化。涂江义等[26]利用电针刺激对外源性骨髓间充质干细胞在脑出血大鼠脑内分化的研究表明在同一时间点电针组与单纯BMSCS组相比，NF-200与GFAP阳性细胞的阳性细胞率显著上升。督脉电针和神经干细胞移植联合应用使受损伤脊髓组织产生神经生长活性物质[27]。

近年来国内学者做了许多中药及复方诱导BMSCs向神经元样细胞分化的实验研究，并取得了可喜的结果。王新生等[28]和曹慧等[29]皆采用不同浓度的黄芪注射液分组诱导BMSCs，免疫细胞学显示NSE、NF均呈阳性，NSE基因表达明显升高。黄芪首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并促进已分化的细胞进一步成熟、老化。侯阳等[30]运用黄芪多糖为诱导剂，BMSCs出现形态学变化，Tuj1阳性表达，逐步形成典型的神经元样细胞。且实验中表明应用化学诱导剂存在细胞只能短期存活的问题。常宏等[31]证实丹参注射液在体外可将大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞，免疫细胞学显示巢蛋白、NSE、NF-M表达阳性。胡琳燕等[32]在此基础上研究发现细胞在高钾刺激下细胞内钙流增加，细胞突触发生胞吞胞吐，具有正常的突触循环功能。杜红阳等[33]使用地黄多糖诱导30分钟后即可出现神经元样细胞，表现为细胞胞质收缩，有突起长出，神经样细胞神经标志物nestin，NSE，GFAP均有表达，且高于其他组。红景天苷可通过抑制Ca2+/CaM信号通路或者激活ERK1/2和PI3K/mTOR信号通路，促进BMSCs向神经样细胞定向分化[34-35]。

4 针药诱导BMSCs分化为成骨细胞

由于各种原因造成的骨缺损的后期修复一直是骨科领域的难题之一。随着细胞生物学和生物材料科学的发展，骨缺损的修复进入了组织工程学修复研究时代[36]。BMSCs在多种细胞因子和微环境的影响下能产生骨前细胞，然后形成骨原细胞、前成骨细胞、功能性骨形成细胞，最后形成成骨细胞[37]。成骨细胞是起源于间充质的骨祖细胞，培养细胞的形状不能作为鉴别细胞类型的主要标志，碱性磷酸酶（AKP）是成骨细胞分化成熟标记酶，AKP染色强阳性是成骨细胞的重要特性之一[38]。此外，成骨细胞表型标志如骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原和ALB及以体外矿化等功能特征，可作为成骨细胞鉴定标准[39]。

去卵巢大鼠针刺后血清能从基因水平影响成骨细胞OPG，RANKL的表达，具有促进破骨细胞凋亡、抑制破骨细胞骨吸收功能的作用，从而治疗绝经后骨质疏松症[40-41]。电针刺激“百会穴”可以在骨折的各个时期促进骨折愈合，加速骨折部位神经修复；持续电针刺激不仅可使破骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞增多，还可使骨痂生成时间提前、体积增大，促进骨折愈合[42]。

杜仲是中国名贵滋补中药，主入肝、肾经，具有补益肝肾、强筋壮骨、防止肌肉骨骼老化等功效。朱丽华等[43]应用醇提、沉淀、层析和色谱方法初步分离了杜仲诱导BMSCs成骨分化的有效成分，高效液相色谱仪获得的其中2个组具有显著刺激BMSCs成骨分化标志基因碱性磷酸酶表达的作用，但2个组分还不能确定已经为化学单体。张贤等[44]实验提示杜仲中含有多种复杂成分会导致诱导后形成钙化结节的细胞与成脂分化的细胞共存于同一培养板中，成骨标志基因碱性磷酸酶和成脂标志基因过氧化酶体增殖物激活受体均上调。陈伟才等[45]发现杜仲叶提取物能诱导BMSCs分化为成骨细胞，同时抑制其向脂肪细胞分化，其中10-4，10-5g/mL的杜仲叶提取物作用明显。曾建春等[46]实验证实肉苁蓉含血清可诱导BMSCs向成骨细胞分化，松果菊苷作为肉苁蓉中的一种生物活性成分，可能是肉苁蓉中发挥诱导BMSCs向成骨细胞分化的有效成分。尉大为等[47]就这一方向进行探索，并取得实验结果，松果菊苷可以促进体外培养的BMSCs向成骨细胞分化，其作用机制与BMP2、Smad1、Runx2表达增加有关。武密山等[48]实验结果认为川续断皂苷VI具有促进BMSCs增殖和向成骨细胞分化的能力，并在基因水平上为筛选促进骨形成的有效药物提供了作用靶点。李树强等[49]实验结果表明土鳖虫防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头的微循环，同时还与其抑制激素诱导下的BMSCs成骨分化减少有关。除单味中药外，还有许多学者应用方剂进行诱导BMSCs骨向分化。其中，颜春鲁等[50]应用补肾方剂加味左归丸可明显促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化，改善骨组织的质量，促进骨组织再生。

骨髓间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，特别是对于治疗血液系统、心脑血管、骨缺损、骨折不可自愈等疾病尤为重要。针刺属于较为环保的治疗方法，对人体基本无影响，通过疏通经络、行气活血，达到调理人体机能的作用。针刺疗法对外科病有较好的治疗作用，如骨质增生、劳损均有较好的疗效。尤其骨折后出现的强直性关节炎，通过针灸、中药熏洗，可达到较好的效果，且无毒、副作用。但是有关针刺诱导BMSCs分化为软骨细胞和心肌细胞的报道鲜少。中药同样具有价廉、安全性高等多项优点，通过对天然中药以及其醇取物、复方诱导BMSCs的定向分化，可使其作为种子细胞治疗更多疾病，开拓更为宽广的领域。相信随着对BMSCs的不断深入研究，针刺和中药诱导BMSCs的多向分化的重要作用将得到更好发展。