缺氧条件下GDF—15对心肌微血管内皮细胞成管的影响

尚小森++卫兵艳++刘田福++陈小平

【摘要】目的 通过缺氧发生装置将心肌微血管内皮细胞（CMECs）进行缺氧，转染GDF-15相关病毒，观察其对CMECs成管的影响。方法 将CMECs分为五组：空白对照组、GDF-15siRNA转染组、干扰对照组、过表达GDF-15组、过表达对照组，以上各组在缺氧发生装置中进行缺氧干预，Western blot测定各组细胞GDF-15蛋白的表达情况。通过内皮细胞成管实验，观察各组在缺氧条件下CMECs管腔结构形成情况。结果 过表达组较其他组GDF-15蛋白表达明显增加，干扰组明显降低，缺氧条件较常氧，CDF-15表达增高。缺氧6h时CMECs过表达GDF-15组在Matrigel Matrix上形成管腔结构，而GDF-15siRNA转染组及对照组均未形成管腔结构。结论 缺氧条件能促进CMECs中 GDF-15的表达，GDF-15能够促进CMECs增殖及血管新生，为GDF-15在急性心肌梗死侧支循环方面的研究奠定了基础。

【关键词】急性心肌梗死；侧支循环；心肌微血管内皮细胞；生长分化因子-15

【中图分类号】】R363 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.31..03

Explore the effects of GDF - 15 on the myocardial microvascular endothelial cells into a tube under hypoxia

SHANG Xiao-sen1，WEI Bing-yan2，LIU Tian-fu2，CHEN Xiao-ping1*

（1.Department of Cardiology， Taiyuan Central Hospital，Shanxi Taiyuan 030009，China；2.Laboratory Animal Center， experimental animal and human disease animal model Shanxi Key Laboratory， Shanxi Medical University，Shanxi Taiyuan 030001，China.）

【Abstract】Objective Through hypoxia generator make myocardial microvascular endothelial cells hypoxia， transfect GDF-15 virus， Observe its effects on CMECs into tube.Methods CMECs can be divided into five groups： blank control group， GDF-15siRNA group， control group of interfere， overexpression of GDF - 15 groups， control group of overexpression. Put the above groups into hypoxia generator ；By using Western-blotting to evaluate the expression of GDF-15 under the hypoxia condition. By endothelial cells into tube experiments，observe CMECs lumen structure formation of each group.Results Overexpression group than other group GDF - 15 protein expression significantly increased， interference group significantly decreased， and the expression of GDF-15 under hypoxia is higher than oxygen condition. CMECs of overexpression group lumen structure formated in hypoxia 6h， opposite to GDF-15siRNA and other control groups.Conclusion Hypoxia conditions can promote the expression of GDF–15 of CMECs，GDF-15 can promote the proliferation and formation of collateral circulation of CMECs.It laid a foundation for the research of GDF-15 on collateral circulation in acute myocardial infarction.

【Key words】Acute myocardial infarction；Coronary collateral circulation；CMECs；GDF-15

目前，人們在精神及生理方面承担着越来越大的压力与责任，这与当今社会逐渐加快的工作节奏密不可分，冠状动脉疾病也随之逐渐增多，给国家带来巨大的社会负担，并造成严重的医疗资源消耗及劳动力损失。其中，急性心肌梗死则为头号杀手，它是由于冠状动脉血管壁的痉挛或狭窄、闭塞所致，随病情进展，严重时可致心力衰竭[1]。急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction AMI），是在冠状动脉粥样硬化不稳定斑块破裂的基础上，产生冠脉急性血栓栓塞所致。对于冠心病，尤其是急性心肌梗死的有效预防和及时治疗已成为目前心血管疾病领域的重要研究课题。有研究发现，急性心肌梗死（AMI）冠脉血流闭塞时，尤其是发病3～6 h内的心梗患者，其侧支血管的形成对梗死面积的大小起至关重要的调节作用，良好的侧支循环可以维持AMI相关区域心肌的活性，可有效保护心功能，对患者的临床预后及生活质量有极大的改善[2]。新生血管是维持病理或正常组织血液供应的重要机制之一，在急性心肌梗死时，对心肌细胞缺血、缺氧所产生的症状亦具有明显改善作用，其中，侧支循环的建立则尤为重要[3]。并且它是心肌以及其他脏器对于组织缺血产生的应答和自我保护机制。endprint

2006年发表在Circulation Research的两项研究首先报道了生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF-15），TGF-β超家族成员之一，在缺血性心脏疾病中发挥着重要的保护机制[4]。研究发现，GDF-15参与了缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion）损伤后缺血心肌的修复。随后，大量报道显示：GDF-15是多种心源性疾病重要的诊断marker和预后指标，故此，在缺血缺氧微环境中的GDF-15水平变化，以及GDF-15如何调控心肌细胞存活，血管新生以及改善心脏功能的基础方面验证研究尚不明确。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

DMEM高糖培养基、胎牛血清购于美国的Gibco公司；GDF-15 siRNA慢病毒、过表达GDF-15慢病毒购于Elabscience生物科技有限公司；Anti-GDF15抗体（兔单克隆抗体）抗体购于美国abcam公司；GDF-15引物及β-actin引物均于美国Gene Copoeia公司构建。

1.2 细胞来源

心肌微血管内皮细胞（CMECs）购于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

取CMECs复苏后在37℃下、5%二氧化碳（CO2）培养箱中进行細胞培养，待细胞长满融合后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法，按1∶3分瓶传代。

1.3.2 细胞进行病毒转染及分组

CMECs分5组：正常CMECs为空白对照组、GDF-15siRNA转染组、干扰对照组、过表达GDF-15组、过表达对照组。转染8 h后将各组细胞换液，每组各加2ml高糖完全培养基，于37℃，5%CO2培养箱中继续培养，待转染72 h后用嘌呤霉素进行抗性筛选。继续培养细胞、传代。再将以上5组分为细胞缺氧模型制备组及常氧组。

1.3.3 Western blot测定各组细胞在常氧及缺氧6h GDF-15蛋白表达情况

处理后的细胞用PBS缓冲液清洗干净，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液在冰上裂解30 min，12000×g离心25 min（4℃），收集上清液。BCA法测定蛋白浓度。蛋白高温变性，加样，5%的浓缩胶和15%的分离胶进行跑胶，转膜，用5%BSA封闭2 h，一抗4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗3遍，每次5 min，二抗室温孵育2h，TBST缓冲液洗3遍，每次5 min，洗净，显色，扫描。

1.3.4 CMECs体外成管实验

用预冷的枪头将基质胶在冰上以每孔50 μl铺于96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中静置1 h，之后每孔加入100 μl的细胞悬液（2×104/孔）。按照5个分组处理细胞6 h后，观察各组细胞管状排列状况及管状结构数量、完整程度，并随机选取5个视野，应用Image J软件分析显微镜下每个视野小管数量，结果以与正常组相比的百分数表示。

2 结 果

2.1 各转染组CMECs72 h后的生长情况如下图所示

GDF-15过表达组细胞生长明显比其他组快，GDF-15siRNA组明显比其他组慢。

2.2 对各组细胞进行缺氧处理，如下图所示

观察发现，缺氧12 h时90%以上细胞已坏死，因此取缺氧时间点为6 h。

2.3 常氧及缺氧6 h，各组GDF-15的表达情况

进行病毒转染后，观察常氧及缺氧6 h时各组细胞GDF-15蛋白的表达情况：GDF-15过表达组实现了GDF-15过量表达，GDF-15siRNA转染组实现了GDF-15的低表达，且缺氧后各组GDF-15蛋白表达量较常氧时均有所增加，缺氧刺激了GDF-15的表达。

2.4 缺氧6h时，CMECs成管实验结果

GDF-15过表达组的CMECs细胞在Matrigel Matrix上形成管腔结构，而GDF-15siRNA组及对照组均未形成管腔结构。

3 讨 论

心肌梗死（Myocardial Infarction MI），是心肌缺血性坏死，是在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久缺血导致心肌坏死。急性心肌梗死（AMI）可发生心律失常、休克或心力衰竭，属急性冠脉综合征的严重类型。如何有效地预防及治疗冠心病，特别是急性心肌梗死，已成为目前心血管疾病研究的重要领域。在我们前期的临床研究中发现，GDF-15具有促进急性心肌梗死侧枝循环形成的作用，本研究根据体内急性心肌梗死时的组织缺氧环境构建缺氧发生装置，验证GDF-15能否促进内皮细胞增殖及新生。在实验过程中发现：与缺氧6 h相比，当缺氧2 h时，各组均未出现较明显的实验结果；缺氧12 h时，约90%的细胞发生坏死；因此选择缺氧6 h的时间点进行观察与研究。

Western blot实验表明：病毒转染后，GDF-15过表达组实现了GDF-15高表达，GDF-15siRNA组实现了GDF-15低表达。缺氧条件下各组GDF-15较常氧组表达量增多，说明缺氧可能是GDF-15的一个刺激因素。

内皮细胞成管实验表明：观察缺氧6 h时各组在Matrigel Matrix的成管情况，过表达GDF-15组较空白对照组细胞形成管腔样结构达90%以上，GDF-15siRNA转染组未形成管腔样结构。实验证明，GDF-15可明显促进内皮细胞成管，可能为改善缺血心肌的局部血液循环，促进血管新生以及侧枝建立等起到关键作用。

综上所述，GDF-15具有明显促进内皮细胞增殖，并形成管腔的作用，从而进一步的阐明了GDF-15可以促进急性心肌梗死侧枝循环的形成，为缺血性心脏病及急性心肌梗死疾病的预防及治疗运用提供安全性必要保障。在下一步的研究中，我们将从细胞和动物模型水平两方面对GDF-15是如何促进急性心肌梗死侧枝循环的形成及其作用机制进行更深入的研究。

参考文献

[1] 顾会平，吴明煜，郭晓红.姜黄素对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与Toll样受体4/核因子 B信号通路的相关性[J].中国生物制品学杂志，2016，9（29）：932-935.

[2] Andrew P， Patrick J，Bradford G，et al.Identification of a plasma metabolomic signature of thrombotic myocardial infarction that is distinct from non-thrombotic myocardial infarction and stable coronary artery disease[J].PLoS One，2017，12（4）：91-98.

[3] Koushik R，Asma K，and Robert J H.Recent advances in the diagnosis and treatment of acute myocardial infarction [J].World J Cardiol，2015，7（5）：243-276.

[4] 宋和鉴.生长分化因子15（GDF-15）对缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡、血管新生的影响及机制的研究[M].2014，5：2-4.

本文编辑：吴宏艳endprint