192例甲状腺乳头状癌中BRAFV600E基因突变与临床病理因素的关系

李鸿涛， 罗 琳， 马斌林

(新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺头颈外科， 乌鲁木齐 830011)

近年来，甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，在分化型甲状腺癌中，80%～90%为甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid of carcinoma,PTC),PTC发病率逐年升高，以甲状腺微小乳头状癌(PTMC)发病率升高最为显著，据我国恶性肿瘤2015年最新统计报告指出，甲状腺癌以女性患者居多，男∶女=1∶3，占所有女性恶性肿瘤发病排名第四位。

BRAFV600E与PTC临床病理因素如肿瘤大小、颈淋巴结转移、腺外受侵等特征密切相关[1]；所以，该基因V600E的点突变可能是导致甲状腺癌变、侵袭性强及预后差的重要预测分子。本研究回顾性分析192例均经手术病理证实的甲状腺癌患者，对BRAFV600E基因行qRT-PCR检测，分析与临床病理因素相关性，验证BRAFV600E基因突变对甲状腺癌的预后价值，探讨该基因突变对甲状腺癌的诊断预测能力。

1 资料与方法

1.1资料收集新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺头颈外科2015-2016年经手术切除并病理证实的甲状腺癌石蜡组织标本共计192例，其中男性45例，女性147例，年龄22～72岁，中位年龄为46岁，所有病理结果均经2位以上副高级职称病理医师确认。

1.2BRAFV600E基因突变检测方法

1.2.1 组织样本DNA提取 使用QIAampDNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生产，货号：56404)试剂盒，按照使用说明书进行石蜡包埋组织样本DNA提取。取试剂盒中的检测试剂以及阳性质控品，待其融化后短暂离心，置于冰上。根据待测DNA样品的数量，加入TaqDNA聚合酶(1.5 μL/管)至管底，置于冰上。向PCR单管中分别加入13.5 μL待检DNA样品、阴性质控品及阳性质控品，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心(注意：混匀时不要使用旋涡震荡仪；混匀后立即进行后续操作)。将上述DNA样品、阳性质控品及阴性质控品按3 μL/孔，分别加至检测试剂的不同反应孔中，盖紧荧光PCR管盖，轻弹混匀后短暂离心(注意：取、盖管盖时应更换新手套；混匀时不要使用旋涡震荡仪；短暂离心后使试剂保持在管底并立即上机检测)。

1.2.2 荧光定量PCR反应 实时荧光PCR检测通道设定：(1)Stratagene Mx3000P、Roch LC480、BioRad CFX-96需同时选择FAM、HEX通道(参比染料设置为“无”)；(2)ABI7500、Abbott m2000rt需同时选择FAM、VIC通道(参比染料设置为“无”)，PCR反应条件：第一步95℃反应10 min，1个循环，第二部95℃ 15 s，40个循环、60℃ 60 ，40个循环后采集荧光。

1.3统计学处理所有数据整理分析后采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1BRAFV600E基因突变的情况使用荧光定量PCR对BRAFV600E基因表达检测，见目的基因和内参基因扩增曲线平滑(图1、2)。

图1 BRAFV600E基因突变

图2 BRAFV600E基因未突变

2.2BRAFV600E基因突变与甲状腺癌临床病理因素相关性192例甲状腺乳头状癌中BRAFV600E基因突变率为85.42%(164/192)，其中，BRAFV600E基因在微小乳头状癌组的突变率为83.1%(108/130)、BRAFV600E在中央区淋巴结转移组突变率为92.3%(84/91)、BRAFV600E在被膜受侵组的突变率为90.00%(36/40)、BRAFV600E在多灶性组的突变率为67.57%(50/74)。在192例患者中，74.48%为Ⅰ～Ⅱ期患者，89.55%的患者因病情需要未行侧颈部淋巴结清扫，本研究尚未发现性别、肿瘤大小、侧颈部淋巴结转移临床分期等因素与BRAFV600E基因突变有相关性,结果见表1。

表1 192例甲状腺乳头状癌临床病理特征与BRAFV600E基因突变的关系

3 讨论

甲状腺癌是近年来发病率较高的恶性肿瘤之一，射线辐射、碘代谢异常是最常见的危险因素，发病原因及机制尚不十分明确；在甲状腺癌的4种病理类型中，PTC占全部甲状腺恶性肿瘤的60～80%，是临床上最多见的分化型甲状腺癌，PTC的临床预后良好，近年来，随着对分化型甲状腺癌病理亚型的深入研究[2]，部分PTC具有多中心、多灶性生长的生物学特点，易发生颈部淋巴结转移，即“小肿瘤大转移”[3]，提示部分肿瘤组织中存在导致恶性肿瘤侵袭性及复发转移增加的分子机制，影响预后。

有研究指出[4]，BRAFV600E基因在甲状腺乳头状癌中的突变率为29%～83%，平均40%，BRAFV600E基因突变是甲状腺癌中最常见的分子遗传学改变，其主要作用机制是BRAFV600E基因突变导致RAS-RAF-MEK-MAK激酶信号通路异常激活而引起细胞的异常增殖和分化，位于RAS下游的BRAF基因更被认为是启动肿瘤癌变的关键基因之一，其中BRAFV600E约占所有BRAF突变的95%[5]。BRAF基因突变主要集中在分化型癌上，探索BRAF基因及下游信号通路是目前PTC研究的热点方向。

有研究指出，BRAFV600E基因突变是公认的甲状腺预后差的危险因素[6]；2015年，本院开展BRAFV600E基因检测，这对临床预后判断有重要参考作用。本研究回顾性分析既往行BRAFV600E基因检测患者的临床病理资料，分析BRAFV600E基因突变与临床病理因素关系，结果发现BRAFV600E基因突变与中央区淋巴结转移、肿瘤被膜受侵、病灶多灶性及PTMC有统计学意义，这与甲状腺癌预后差的危险因素相吻合，BRAFV600E基因突变与甲状腺癌预后差相关。本研究发现，192例患者中，PTMC所占比例为67.71%，BRAFV600E基因突变率为83.08%，提示部分PTMC可能存在高侵袭性，不能仅凭肿物大小评价诊疗方式和预后，在早期发现时应考虑积极手术而非保守观察；Shi等[7]学者研究发现，PTMC患者合并腺外受侵、淋巴结转移者，BRAFV600E突变率更高，尤其是高细胞亚型者，这与文献报道PTMC早期易合并颈部淋巴结转移的观点相符[8]。当上述任一危险因素存在时，应早期手术并规范治疗。Shi等[9]学者认为，对于中央区淋巴结转移的PTMC患者，BRAFV600E突变是独立的危险因素，但肿瘤直径≤5 mm者未见明确相关性，提示PTMC诊治过程中，应细化分子亚型，明确各型基因分子水平表达特点，精准指导临床工作。本研究分析发现，中央区淋巴结转移、被膜受侵者、多灶性与甲状腺癌的复发高风险因素吻合，提示BRAFV600E与甲状腺癌发生、发展密切相关，BRAFV600E基因突变可作为评判甲状腺癌预后的客观指标。临床应对BRAFV600E阳性病例给予重视并积极处理。

综上所述，BRAFV600E基因突变与诸多临床病理因素关系尚有争议，本研究尚未发现BRAFV600E基因突变与年龄、肿瘤大小、侧颈部淋巴结转移、临床分期有关。这可能与入组人群的选择偏倚、入组数量较少等因素有关。Ahn等[10]研究发现，朝鲜族人群BRAFV600E基因突变尚不能评估甲癌患者预后；这提示在不同种族人群中基因表达水平也有所不同；故今后需对BRAFV600E基因突变进一步深入研究，最终达到靶向诊断和靶向治疗的目标。

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