左归丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织干细胞因子及其mRNA表达的影响研究

王彬，李霄，马凰富，祝雨田，马健雄，王继升，党进，李海松

男性不育症是指结婚1年以上的夫妻，有正常性生活且未采用避孕措施，女方生育能力正常，因男方原因而致不育者。据统计，在全球已婚家庭中，不育夫妇占15%～18%，而其中因男性原因不育者占50%［1］。目前，现代医学对于男性不育症的病因尚不十分明确，目前认为常见的病因有精液障碍、生精障碍、精子卵子结合障碍以及内分泌因素，其中以生精障碍最为普遍［2］。男性不育症引发了诸如社会、医学在内的很多问题，如何寻找解决问题的有效方法已经成为医学界的热点话题。男性不育症以少、弱精子症最为常见。目前西医治疗手段主要包括睾酮、绒毛膜促性腺激素等药物以及辅助生殖技术等，总体治疗效果有局限性。中医治疗注重整体观念和辨证论治，在男性不育症治疗方面有一定的优势，是我国治疗男性不育症的重要手段［3］。历代中医学家对男性不育症病因、病机均有所论述，现代药物研究亦发现许多补肾中药及复方药物在不育症治疗方面有一定优势［4］。左归丸具有补肾精、养精血、化瘀血之功，其治疗男性不育症具有一定的疗效［5］。

左归丸可明显改善生精障碍大鼠的精液质量、附睾肉碱、血清抑制素（INHB）。然而，目前有关左归丸对男性不育症患者生殖功能方面作用的基础研究较少，且对其改善生精功能的机制尚无系统研究。因此，本研究在明确左归丸治疗少弱精子型男性不育症临床疗效基础上，通过观察左归丸对少弱精子症大鼠睾丸干细胞因子（SCF）及其mRNA表达的影响，探讨其改善生殖功能、治疗男性不育症的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2014年3—4月选取SPF级SD雄性大鼠36只〔斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供；许可证号：SCXK(京)2011-0004〕，鼠龄12周，平均体质量（280±30）g。在适宜的温、湿度环境下适应性喂养1周，大鼠自由饮用普通自来水，食用普通固体饲料，光照10～12 h/d，室温24～25 ℃，湿度55%～60%。

1.2 药物与试剂 雷公藤多苷片（安徽新陇海药业有限公司生产，规格：10 mg/片，生产批号：130801）；左归丸（河南宛西制药厂生产，规格：12袋/盒，9 g/袋，批号：131209）。将雷公藤多苷片、左归丸分别研磨成粉末并配制成实验所需浓度的混悬液，置于4 ℃冰箱保存。免疫组化法试剂：SCF抗体（abcam，ab64677）。

1.3 仪器 光学显微镜（奥林巴斯，型号：L340099）；低温离心机（Sigma-Aldrich 西格玛奥德里奇公司3K18）；Sagecreation凝胶成像分析系统（北京赛智创业科技有限公司）；PCR仪（Applied Biosystems美国应用生物系统公司，型号9700）；荧光定量PCR 仪（Roche罗氏，型号 LC480Ⅱ）。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药 将36只SD大鼠随机分为正常组、雷公藤多苷模型组、左归丸治疗组，每组12只。

1.4.2 实验过程 正常组全程给予去离子水灌胃干预［6］；雷公藤多苷模型组实验前4周给予雷公藤多苷40 mg·kg-1·d-1造模（少弱精子症模型），实验5～8周给予去离子水灌胃干预［6］；左归丸治疗组实验前4周给予雷公藤多苷40 mg·kg-1·d-1造模（少弱精子症模型），实验5～8周给予左归丸6 g·kg-1·d-1，实验共计8周。

1.4.3 睾丸组织SCF及其mRNA表达水平检测 饲养8周后，将所有大鼠处死，无菌留取睾丸组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋切片4 ℃保存。采用免疫组化法检测各组大鼠睾丸组织SCF表达水平，使用IPP 6.0软件测定每组SCF阳性表达的平均光密度值即为SCF表达水平，比较各组大鼠睾丸组织SCF表达水平；各组大鼠睾丸组织石蜡切片，室温复温30 min；之后将各组睾丸组织石蜡切片进行常规脱蜡置于湿盒中，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH值7.2～7.4）冲洗3次；置于98 ℃的枸橼酸缓冲液（pH值6.0）中加热20 min以修复抗原，室温冷却，PBS冲洗3次；滴加20%蛋清孵育30 min，PBS冲洗 3次封闭；滴加 3% H2O2-CH3OH，10 min后PBS冲洗3次；稀释的一抗（SCF为1: 800）；每组实验设计抗体来源的IgG作为阴性对照，其中阴性对照滴加PBS于睾丸组织切片上，4 ℃冰箱过夜；室温复温30 min，PBS冲洗3次；加HRP标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次；加DAB显色液，室温下避光反应5～10 min，自来水冲洗2次；用苏木素进行复染1～3 min，自来水冲洗15 min，超纯水冲洗3 min；常规进行脱水及透明；采用Real-time PCR法检测各组大鼠睾丸组织SCF mRNA表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理。计量资料以（x±s）表示，经正态性检验及方差齐性检验后，符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠睾丸组织SCF表达水平比较 3组大鼠睾丸组织SCF表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。左归丸治疗组大鼠睾丸组织SCF表达水平高于雷公藤多苷模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 3组大鼠睾丸组织SCF mRNA表达水平比较 3组大鼠睾丸组织SCF mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。左归丸治疗组SCF mRNA表达水平高于雷公藤多苷模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2、图1）。

3 讨论

SCF及其受体原癌基因蛋白质（c-kit）在男性生殖中起重要作用。在性腺轴的控制下，SCF与生精细胞上的受体c-kit结合，调节生精细胞的自我更新和增殖，从而产生精子［7］。研究表明，SCF/c-kit可调节生殖细胞增殖、分化、减数分裂和细胞凋亡［8］。并且，SCF既可以促进干细胞分裂［9］，又可以抑制体内细胞凋亡，其对干细胞生长具有明显的调控作用。研究显示，SCF与促凋亡因子Bax和抗凋亡因子 Bcl-2具有十分密切的关系，SCF可以通过上调Bcl-2表达水平，降低Bax表达水平，发挥抗凋亡作用［10］。

表1 3组大鼠睾丸组织SCF表达水平比较（x±s）Table 1 Comparison of the SCF protein expression levels in the testicular tissue between the normal group, TG model group and Zuogui pill treatment group

表2 3组大鼠睾丸组织SCF mRNA表达水平比较（x ±s）Table 2 Comparison of the SCF mRNA expression levels in the testicular tissue between the normal group, TG model group and Zuogui pill treatment group

图1 3组睾丸组织SCF mRNA表达水平电泳图Figure 1 Electrophoresis analysis of SCF mRNA expression levels in the testicular tissue in 3 groups

不育症归属于中医学“精冷”“精少”等范畴。中医学多认为其与肾、心、肝、脾等脏有关，而肾为先天之本，其与肾脏关系最为密切。如《黄帝内经》曰：“丈夫二八肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子……”禀赋不足，肾气虚弱日久伤阴，精血耗散或阴虚火旺，精液黏稠难化，发为不育。左归丸以滋阴补肾、填精益髓为法，主治真阴不足证，出自张景岳的 《景岳全书》。该方由六味地黄丸化裁而成，方以熟地滋肾填精，大补真阴，为君药；山茱萸可养肝滋肾，涩精敛汗，山药补脾益阴滋肾，枸杞补肾益精，龟、鹿二胶以血肉有情之品峻补精髓，皆为臣药；菟丝子、川牛膝益肝肾、通血脉为佐药。诸药合用，共奏补肾精、养精血、化瘀血之功效。全方纯补无泄，体现了张景岳“补阴不利水，利水不补阴，而补阴之法不宜渗”“阳中求阴”的思想。临床上用左归丸治疗肾阴亏虚型的男性少、弱精子症，可消除遗精滑泄，腰膝酸软，五心烦热等症状。有研究表明，左归丸对于正常小鼠睾丸、精囊腺有增重作用，能提高正常小鼠血清睾丸酮水平［11］。本研究结果显示，左归丸治疗组睾丸组织SCF及其mRNA表达水平明显增高，与雷公藤多苷模型组比较有差异。

综上所述，左归丸可上调SCF及其mRNA表达水平，促进精原干细胞的分裂和增殖，抑制生精细胞的凋亡。然而SCF只是众多影响生精因素中的一员，左归丸是否对其他凋亡因子亦或通路有影响，以及左归丸改善大鼠生精功能的机制仍有待进一步发掘与研究。

作者贡献：王彬负责文章构思、设计，文章的可行性分析，撰写论文；李霄负责论文数据整理、资料收集及部分论文撰写；马凰富负责实验实施、论文统计分析；祝雨田负责论文修订；马健雄、王继升整理数据；党进负责论文、英文修订；李海松负责文章质量控制和审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

本研究不足：

（1）本研究采用自身前后对照研究的方式进行临床观察，未来的进一步深入临床研究要在此基础上收集更大样本量，设计更为严谨的实验方案；（2）本研究仅涉及干细胞因子（SCF）及其mRNA表达水平，将来要在此基础上检测其他调控生精细胞凋亡因子，深入探索其之间的相互联系，为中医治疗男性不育症的机制提供更为准确的依据。