替米沙坦降压疗效与血管紧张素原启动子区基因多态性关系研究

龚洪涛，杜凤和，陈步星

血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）是一线降压药物，目前临床上应用较为广泛。ARB作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS），通过选择性阻断血管紧张素Ⅱ受体1（AT1）, 进而阻断血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）收缩血管、升高血压、促进醛固酮分泌、兴奋交感神经等作用。高血压患者对于该类药物的降压疗效存在个体差异，RAAS基因多态性可能对降压药物疗效具有一定的预测作用［1-2］。血管紧张素原（AGT）是AngⅡ的唯一前体物质，在RAAS中有非常重要的作用，血浆中AGT水平直接影响AngⅡ的生成，是血压遗传研究的一个重要候选基因［3］。本研究对高血压患者采用替米沙坦单药治疗，在观察降压疗效的同时对AGT基因启动子区单核苷酸多态性（SNPs）位点AGT-6 A/G和AGT-20 A/C基因型进行分析，探讨替米沙坦降压疗效与AGT启动子区基因多态性的关系，为临床降压治疗及药物的选择提供依据。

本文主要内容：

高血压是目前最常见的心血管疾病，但是降压药物的降压疗效存在个体差异，本研究通过分析肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）中的血管紧张素原启动子区基因多态性与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）类降压药物降压疗效的关系，为高血压患者的个体化治疗提供新思路及理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2005年6月—2007年1月首都医科大学附属北京天坛医院门诊符合纳入标准的汉族高血压患者148例，其中男67例，女81例；年龄35～77岁，平均年龄（53.7±10.6）岁。纳入标准：依据WHO/国际高血压学会（ISH）高血压诊断标准［4］，诊断为原发性高血压；1～2级高血压患者即坐位收缩压为140～179 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）， 舒 张 压 为95～109 mm Hg；未用或停用降压药物，并服用安慰剂2周。排除标准：严重肝、肾功能障碍；严重心功能不全；继发性高血压；3个月内发生过心肌梗死及脑卒中；妊娠期或哺乳期妇女。本研究患者均签署知情同意书，本研究经过本院伦理委员会批准。

1.2 给药方法 所有患者给予替米沙坦（德国勃林格殷格翰公司生产）80 mg/d，晨7：00～10：00顿服，共治疗8周。

1.3 人体基本参数和生化指标测定 人体基本参数和生化指标测定方法与本课题组之前研究相同［5］。

1.4 血压测定 每周测血压1～2次，均在上午由同一测量者测量；测量血压时患者静坐10 min，采用标准台式血压计坐位连续测量3次, 每次间隔10 min, 取其均值。记录治疗前后患者的收缩压及其降低幅度均值，舒张压及其降低幅度均值。

1.5 DNA提取 取冷冻乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血 , 水浴解冻；采用 E.Z.N.ATM Blood DNA Kit（OMEGA）试剂盒提取DNA，于-20 ℃保存待用。

1.6 基因分型 用Oligo 6.0软件设计引物（见表1）。总反应体系为 10.0 μl，包括基因组 DNA 20 ng 2.0 μl，PCR 上、下游引物（5 pmol/μl）各 0.6 μl，2×Taq PCR Master Mix 5.0 μl，用灭菌蒸馏水补充至10.0 μl。PCR 反应条件：首先 95 ℃变性 10 min，随后进行35个循环，每一循环包括94 ℃变性30 s，在相应的退火温度（Tm）中退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，最后，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。分别取 PCR 扩增产物10 μl、5 U BsiE I和 Eco0109 I内切酶（美国 Promega公司）、10 ENB缓冲液2 μl，加双蒸水补足体积至20 μl，37 ℃温育 12 h，取 10 μl上述产物，用含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶在电压为100 V的1 ×TAE缓冲液中电泳45 min，于凝胶成像系统下观察并保存酶切结果。

表1 PCR引物设计Table 1 Primer design for PCR

1.7 统计学方法 应用SSPS 19.0软件进行数据分析。计量资料以（x ±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，同组治疗前后比较采用配对t检验，遗传平衡检验采用Hardy-Weinberg平衡检验，计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后人体基本参数与生化指标比较 结果与本课题组之前的研究结果相同［5］。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 AGT启动子区2个SNPs位点 AGT-6 A/G 和 AGT-20 A/C 的基因型分布均 符 合 Hardy-Weinberg平 衡（χ2=3.455、2.739，P=0.063、0.098）。

2.3 AGT-6 A/G、AGT-20 A/C 基因型、等位基因分布AGT-6 A/G的基因型分布情况：AA 83例（56.0%），AG 61例（41.0%），GG 4例（3.0%）；AGT-6 A/G 的等位基因分布情况：A 227个（77.0%），G 69个（23.0%）。AGT-20 A/C基因型分布情况：AA 118例（80.0%），AC 26 例（17.0%），CC 4 例（3.0%）；AGT-20 A/C等位基因分布情况：A 262个（89.0%），C 34个（11.0%）。AGT-6 A/G的GG基因型和AGT-20 A/C的CC基因型较低，因此将AGT-6 A/G的AG基因型和GG基因型合并，AGT-20 A/C的AC基因型和CC基因型合并。

2.4 不同AGT-6 A/G基因型患者治疗前后血压比较AGT-6 A/G的AA、AG+GG基因型患者治疗后的收缩压、舒张压均低于自身治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同AGT-6 A/G基因型患者治疗前、后收缩压及其降低幅度、舒张压及其降低幅度比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

2.5 不同AGT-20 A/C基因型患者治疗前后血压比较AGT-20 A/C的AA、AC+CC基因型患者治疗后的收缩压、舒张压均低于自身治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同AGT-20 A/C基因型患者治疗前、后收缩压及其降低幅度、舒张压及其降低幅度比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

表2 不同AGT-6 A/G基因型患者治疗前后血压比较（x±s, mm Hg）Table 2 Comparison of SBP and DBP measured before and after treatment and the decrease in SBP and DBP in patients by AGT-6 A/G genotype

表3 不同AGT-20 A/C基因型患者治疗前后血压比较(x±s, mm Hg）Table 3 Comparison of SBP and DBP measured before and after treatment and the decrease in SBP and DBP in patients by AGT-20 A/C genotype

3 讨论

高血压是一种多基因遗传疾病，降压药物治疗是临床控制高血压的最主要途径，但高血压患者对降压药物的疗效存在个体差异，因此高血压患者需要进行个体化治疗，如何为每例高血压患者选择最适合的降压药物，已经成为一个新的挑战。RAAS在高血压发生、发展过程中起着非常重要的作用，该系统的基因多态性可能影响个体对降压药物的反应。本研究选择汉族轻中度高血压患者，给予替米沙坦治疗8周后，研究AGT启动子区 2个 SNPs位点（AGT-6 A/G 和 AGT-20 A/C）基因型与替米沙坦降压疗效的关系，结果未发现AGT-6 A/G、AGT-20 A/C基因型与替米沙坦降压疗效有关。

AGT基因位于染色体1q42-q43，由5个外显子和4个内含子组成。AGT基因核心启动子区上游存在一个AGT核心启动子结合因子1的结合位点和hAG核心启动子元件1，两者相互结合，影响AGT基因的基础转录速率［6］。AGT-6 A/G、AGT-20 A/C 位于 AGT 的转录调控区，影响AGT基因的转录活性［7］。已有研究表明，AGT-6 A/G和AGT-20 A/C多态性与第2号外显子235M/T多态性之间可能存在协同作用，这可能与中国汉族人发生原发性高血压病有关［8］。另一项Meta分析显示，AGT-6 A/G、AGT-20 A/C多态性均与中国汉族人发生高血压有关［9］。MARKOVIC等［10］研究证实，AGT-6 A/G 和AGT-20 A/C多态性与非洲裔美国人和高加索人群的原发性高血压病有关。在AGT基因与降压药物疗效的相关性研究中，JIANG等［11］对于单独服用利尿剂的高血压患者研究发现，与携带AGT AA基因型患者比较，携带AGT-6 G等位基因患者舒张压下降幅度明显升高，差异有统计学意义（P=0.025）。FILIGHEDDU等［12］研究了RAAS基因多态性与福辛普利降压疗效的关系，结果未发现AGT-6 A/G多态性与福辛普利降压疗效存在相关性。因此对于不同种族、居住环境的人群，使用不同的降压药物进行研究，其研究结果也不尽相同。

本研究尚存在一定局限：AGT启动子区有多个SNPs位点，本研究只选择其中2个进行探讨，且样本量较小，研究结果有待进一步证实，而且是否存在多个位点联合作用亦有待进一步探讨。因此关于AGT启动子区基因多态性与ARB降压疗效的关系有待进一步探讨。

综上所述，在汉族高血压患者中，AGT-6 A/G、AGT-20 A/C多态性可能与替米沙坦降压疗效无关。

作者贡献：龚洪涛进行文章的构思与设计、数据收集与整理、结果的分析与解释，撰写论文并进行论文的修订；龚洪涛、杜凤和、陈步星进行研究的实施与可行性分析，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。