二甲双胍通过调节FGF21/adiponectin轴改善NAFLD大鼠脂代谢紊乱

申 甜，雷 涛，陈 琳，徐碧林，夏 娟，汪红平

0 引言

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝脏内三酰甘油(TG)过度聚集为特征的肝脏疾病，在西方国家糖尿病患者群中发病率达21%～78%[1]，胰岛素抵抗(IR)是NAFLD和2型糖尿病(T2DM)发生及疾病发展变化的中心环节。脂联素(Adiponectin)与瘦素、肿瘤坏死因子等脂肪因子不同，具有抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化的作用，参与糖脂代谢及炎症反应等多个生理过程，与 NAFLD 密切相关[2]。近年来新发现的成纤维生长因子21(Fibroblast growth factor 21，FGF21)可部分依赖PPARγ活性，刺激脂肪细胞中adiponectin的转录及分泌。且Lin等[3]证实，外源性重组FGF21因子需要依赖脂联素而发挥降糖降脂作用。FGF21/adiponectin轴通过调节多器官而维持机体的糖脂及能量代谢平衡，因此将成为治疗NAFLD的新靶点。多项临床研究证实，二甲双胍可上调NAFLD患者血清脂联素水平而改善IR，本研究采用高脂饮食建立大鼠NAFLD模型[4-5]，探讨二甲双胍是否通过调节内源性FGF21/adiponectin轴变化而逆转NAFLD的进程。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂 健康雄性清洁级SD大鼠40只，4周龄，体重(170±20) g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，由上海市普陀区中心医院动物饲养中心分笼喂养。正常普通饲料(蛋白质21%、脂肪6%、碳水化合物55%)，高脂饲料(83%基础饲料，10%猪油，5%蔗糖，1.5%胆固醇，0.5%胆盐)由上海斯莱克实验动物有限公司定制生产。盐酸二甲双胍片(500 mg/片，上海施贵宝制药公司，批号：1112103)。胰岛素(FINS)、脂联素、FFA及三酰甘油试剂盒均购自上海钰森生物科技有限公司；逆转录试剂PrimeScript TM RT 购自THERMO公司，荧光定量PCR试剂盒 SYBR premix EX TaqTMⅡ购于日本TaKaRa Bio株式会社。

1.2 方法 ①NAFLD模型制备及分组：为适应环境，40只大鼠予以普通饲料适应性喂养1 周后，根据随机数字表法分为正常对照组(NC组，15只，普通饲料)和高脂饮食组(HF组，25只，高脂饲料)喂养8周，两组随机抽取5只(NC1组、HF1组)，经称重、检测血糖血脂等生化学指标及行肝组织病理检测，以体重、肝脏湿重明显增加，血空腹胰岛素(FINS)、稳态胰岛素评价指数(HOMA-IR)明显升高，血脂指标(TC、TG)及肝功能指标(ALT、AST)明显升高，肝脏病理组织学示肝小叶结构模糊，出现细胞肿胀，胞核消失或被脂肪空泡，证实HF组NAFLD造模成功。剩余20只HF大鼠再随机分为2组：模型组(HF组，等体积生理盐水)、二甲双胍干预组[HF+M组，加二甲双胍500 mg/(kg·d)]，每组10只，连续灌胃8周。药物干预期间，对照组大鼠继续给予常规饲料喂养，模型组及二甲双胍组大鼠继续予以高脂饲料喂养。实验结束时，各实验组大鼠禁食不禁水12 h，行乙醚腹腔麻醉大鼠，称重，腹主动脉采血，分离血清并转移至新的EP管，放置-80 ℃低温冰箱保存；同时迅速分离取出肝脏组织并称重，甲醛溶液固定，制备石蜡切片，行HE染色观察肝脏病理组织学变化；其余肝脏及部分附睾脂肪组织放置于-80 ℃冻存备测Real-time PCR。

②血清指标生化检测：采用日本OLYMPUS公司AU2700型全自动生化检测仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、TG、空腹血糖(FBG)、血清空腹胰岛素(FINS)、肝脏TG含量、FGF21、脂联素，均按照ELISA 试剂盒操作说明进行检测，计算胰岛素抵抗指数IRI=(FINS×FBG)/22.5。

③肝脏病理组织学观察：取相同部位肝右叶，大小约2 cm×2 cm×0.3 cm；迅速取出肝脏并称重，甲醛溶液固定，制备石蜡切片，行HE染色观察肝细胞脂肪变性程度、炎性活动度及肝纤维化的程度，进行肝组织病理学观察。

④氯仿∶甲醇(2∶1)肝脏匀浆液的制备及TG含量测定：称取适量肝脏组织，放入玻璃匀浆管中，加入3倍体积的甲醇，1 500 r/min电动匀浆5 min，倒入离心管中，再加入6倍体积的氯仿，漩涡混合器混匀，制备10%的组织匀浆，根据TG测定试剂盒对TG含量进行测定。

⑤RT-PCR法检测肝脏脂联素adiponectin、FGF21、AMPK mRNA表达。脂肪组织adiponectin mRNA表达：取冻存脂肪及肝脏组织，采用TRIzol抽提大鼠肝脏总RNA，按Superscript Ⅲ逆转录酶试剂盒说明逆转录得到cDNA。各基因引物序列：adiponectin:5′-GTCTCCGTGCTTCCGATGAA-3′，5′-GGTCAAACTGGACTTGGGGT-3′；FGF21:5′-GTGCGAGGCATACCCCATC-3′，5′-CCGTCCTCCCTGATCTCCA-3′；AMPK:5′-GAGCCCTGAACTTGCTTTTACA-3′，5′-TGTCCGTTCTATGCGCTGG-3′；GAPDH：5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。扩增完成后，应用反应产物的溶解曲线检测其均一性，每个反应重复3次，ABI7300 SDS Software自动分析荧光信号并将其转换Ct值。以GAPDH作为内参基因对所有样品进行规一化处理，ΔCt为目的基因Ct值与内参Ct值的差值，最终以2-ΔΔCt作为目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 NAFLD模型建立 喂养8周，NC1组、HF1组大鼠生化学指标比较，见表1。

2.2 喂养8周末肝脏组织学比较 肉眼观察：NC组喂养8周肝脏形态正常，HF组肝脏外形稍饱满圆钝，色红，质地较脆；光镜观察：NC组肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶肝细胞分界清晰，胞核圆，位于细胞中央，胞质丰富，未见肝细胞脂肪变性或坏死及炎性细胞浸润；HF组肝小叶结构模糊，肝索放射状排列不明显，大部分细胞肿胀，胞核消失或被脂肪空泡。见图1。

图1 肝脏组织学比较(HE，200×)

2.3 二甲双胍干预8周后各组生化指标、FFA测定及胰岛素抵抗指数比较 见表2。

2.4 肝组织病理HE染色 NC1组肝细胞形态、小叶结构及汇管区均未见异常，几乎未见肝细胞脂肪变性。HF1组大鼠肝小叶脂质沉积明显，肝细胞脂质变性大部分为小脂滴，伴有气球样变，肝窦间隙变窄，HF+M组大鼠肝小叶结构仍有紊乱，细胞脂滴变小，气球样变减少，无明显坏死，肝窦间隙无明显变窄。见图2。

2.5 各组肝脏adiponectin、FGF21、AMPK mRNA表达及脂肪组织adiponectin mRNA表达 与对照组比较，模型组肝脏AMPK、adiponectin mRNA表达均下降；二甲双胍干预后，肝脏FGF21、AMPK mRNA表达明显增加(P<0.01)，而adiponectin mRNA表达无明显变化；与模型组比较，二甲双胍可明显干预脂肪组织adiponectin mRNA表达。见图3、图4。

表1 NC1组、HF1组大鼠生化学指标比较

注：与NC组比较，*P<0.05

表2 三组大鼠生化学及胰岛素抵抗指标比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与HF组比较，#P<0.05

图2 肝组织病理HE染色结果(HE，100×)

图3 肝组织adiponectin、FGF21、AMPK mRNA表达

图4 脂肪组织adiponectin mRNA表达

3 讨论

大量研究表明，NAFLD与T2DM、肥胖等代谢综合征密切关联，并可预测T2DM和心血管疾病事件(CVD)的发生[6-8]。目前有关NAFLD发病机制公认的是“二次打击”学说[9]，即胰岛素抵抗造成的脂质代谢紊乱对肝脏造成第一次打击，而氧化应激反应的激活对肝脏造成第二次打击。

脂肪组织除作为体内最大的能量提供者之外，还是人体内重要的内分泌器官，可分泌多种细胞因子，包括游离脂肪酸(FFA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、IL-6、脂联素、瘦素、抵抗素等，而营养过剩会造成这些促炎及抗炎因子的失平衡而加重胰岛素抵抗介导的脂质过量聚集。脂联素是1995年Sherer等[10]首次报道的一种由脂肪组织分泌的血浆激素蛋白，与肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗有关，是体内唯一与体脂含量呈负相关的脂肪因子。脂联素转基因小鼠的血浆TG和FFA较对照组均下降，肝脏脂肪沉积减轻[11]。FGF21是最先由 Nishimura等[12]于2000年从小鼠胚胎组织中分离出的FGF 基因家族中的一位新成员，主要由肝脏分泌入血，对维持脂代谢的稳态发挥重要作用。研究显示，血清 FGF21 表达水平与NAFLD肝脏脂肪变性严重程度显著相关，成为目前国内外研究的热点[13]。2005年Kharitonenkov等[14]首次报道FGF-21具有调节血糖、改善胰岛素敏感性及抑制肝糖输出的作用，且与循环脂联素水平增加以及体脂含量减少有关。

本实验结束时，模型组大鼠体重及血清TC、TG、ALT、AST、FBG、FINS，以及肝脏TG含量、HOMA-IR高于正常对照组，但血清adiponectin水平下降，FGF21水平升高；二甲双胍干预后，HF组大鼠血清TC、TG、FFA、FBG、ALT、AST降低，肝脏TG含量及HOMA-IR降低，血清adiponectin、FGF21水平升高。鉴于adiponectin、FGF21对调节糖脂代谢及能量平衡的正性作用，推断二者可能参与二甲双胍对糖脂代谢及胰岛素抵抗的调控作用。此外，肝脏病理学提示，二甲双胍可以有效减轻肝脏脂质沉积，逆转NAFLD的脂肪变性。

二甲双胍是经典的降糖药物，可以改善肝脏胰岛素抵抗，并改善外周器官对胰岛素的敏感性，促进脂肪酸的氧化，同时还达到抑制脂肪生成的目的。在NAFLD的诊疗指南[15]中，也推荐二甲双胍用于人类NAFLD的治疗。2005年的一项随机开放研究中，与维生素E或饮食控制比较，二甲双胍可更好地改善NAFLD患者的转氨酶水平和肝脏组织病变[16]。Shargorodsky等[17]发现，使用二甲双胍可通过调节脂联素和TNF-α基因表达而改善脂肪代谢，部分逆转NAFLD患者肝细胞脂肪变性和炎性反应。

本研究PCR结果提示，模型组大鼠肝脏组织AMPK、adiponectin mRNA表达量较对照组明显下降，而FGF21 mRNA 略有增加的趋势；说明在糖脂代谢紊乱的内环境下可刺激肝脏分泌FGF21，而AMPK和adiponectin mRNA表达受抑制。二甲双胍干预8周后，肝脏AMPK、FGF21 mRNA表达较模型组明显增加，与Nygaard等[18]报道一致，adiponectin mRNA无明显变化；然而，脂肪组织adiponectin mRNA较模型组明显升高。

脂联素主要由脂肪细胞特异性分泌，在肥胖和代谢综合征人群中明显下降；而FGF21水平在代谢疾病(如：IR、T2DM、NAFLD、冠心病、PCOS)中明显升高。二者之所以呈现相反的变化，其主要原因如下：①FGF21与其他炎性细胞因子及激素(如儿茶酚胺、胰岛素、糖皮质激素、TNF-α、IL-6)、内质网应激，氧化应激等共同参与调节adiponectin的分泌；②肥胖状态下，脂肪组织存在FGF21抵抗。用外界注入重组FGF21或ADPN，可以改善肥胖相关的氧化应激和胰岛素抵抗，对体重和高血糖有益。总之，二者是对调节糖脂代谢及胰岛素抵抗具有多效作用的代谢因子。

本研究表明，使用二甲双胍可以刺激肝脏AMPK及FGF21 mRNA表达明显增加，且血FGF21浓度增加，通过结合脂肪组织FGF21复核受体刺激脂肪组织adiponectin的分泌及表达，发挥增加胰岛素敏感性及减轻脂质沉积的作用。同样，国外动物有实验提示，FGF21-adiponectin 轴通过调节多器官对话而保护糖脂代谢平衡。综上所述，二甲双胍作为AMPK激活剂，可以显著增加肝脏FGF21表达及分泌，进而刺激脂肪组织分泌剂表达adiponectin水平，最终通过调节FGF21-adiponectin 轴而发挥降糖、逆转肝脏脂肪变性及改善胰岛素敏感性的作用，为二甲双胍治疗NAFLD提供有力的证据。有关FGF21如何刺激脂肪adiponectin的过表达，以及与二甲双胍的浓度及血脂、血糖的浓度之间是否存在量效反应，今后仍需要进一步的研究。

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