兽用烟酸阿莫西林可溶性粉对副猪嗜血杆菌病的治疗试验

孟冬霞，刘晓东，武果桃，任 杰，卫顺生，马政禹，赵 娟，夏艳婷

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032；2.山西科元动物胚胎工程中心，太原 030032；3.武乡县畜牧综合执法大队，长治 046300；4.山西农业大学，晋中 030801）

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemo philus parasuis,Hps）引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎，特点为高热、关节肿胀、中枢神经症状及呼吸道紊乱。临床症状主要表现为被毛粗乱、消瘦、咳嗽、发热、呼吸困难、跛行及共济失调等，2周龄到4月龄的猪均易感，通常见于5～8周龄的猪，主要在断奶后和保育阶段发病，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达50%[1-2]，给养猪业造成严重的经济损失。

阿莫西林又名羟氨苄青霉素，属半合成广谱抗生素，是兽医临床中应用最普遍的抗生素之一。其抗菌机理是干扰敏感细菌细胞壁黏肽的合成，抑制细菌的代谢酶，触发细菌自身的自溶酶活性，使细菌肿胀、变形破裂、溶解死亡。由于阿莫西林水溶性不好，临床应用时易造成药物损失，无形中增加养殖成本。为提高阿莫西林溶解度及生物利用度，利用烟酸和阿莫西林通过混合法制备烟酸阿莫西林可溶性粉，为验证其对敏感菌所致副猪嗜血杆菌病的疗效特进行本试验。

1 材料与方法

1.1 试验药品、标准菌株与主要试剂

阿莫西林（含量为99.9%，批号为101150510112），华北某有限公司生产；烟酸（含量为99.8%，批号为151203），天津某公司生产；烟酸阿莫西林可溶性粉，由GMP兽药厂太原市奥福莱动物药业有限公司根据项目组提供的原料及配方进行生产。将其用生理盐水稀释至所需浓度，用0.22 μm滤膜过滤除菌（过滤后对其活性无影响，热原物质均能达到肌肉注射标准，无菌检测合格），供肌肉注射用。氨苄西林可溶性粉（10%，批号为20151221）、注射用氨苄西林钠（1.0 g，批号为20151124），某有限公司生产。

金黄色葡萄球菌标准菌株，购自中国兽药监察所；胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、药敏纸片、微量生化鉴定管购于杭州微生物试剂有限公司；配制TSA平板、TSB肉汤时，分别添加NAD（烟酸胺腺嘌呤二核苷酸）和犊牛血清；NAD购自生工生物工程（上海）股份有限公司；犊牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；烟酸阿莫西林药敏纸片自制；细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、DL 2 000 DNA Marker等购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 试验动物、分组及给药方法

2017年6月13—17日进行治疗试验。在武乡县上司乡某猪场，选择自然发病、确诊为副猪嗜血杆菌病、有治疗价值、出生后均未接种过副猪嗜血杆菌疫苗、体重11.7～15.6 kg、41～52日龄的杜长大病猪162头，随机分为9组，每组18头，分别为烟酸阿莫西林混饮高剂量组，每100 kg水中加入本品15 g，1 d 2次，连用5 d；烟酸阿莫西林混饮中剂量组，每100 kg水中加入本品10 g，1 d 2次，连用5 d；烟酸阿莫西林混饮低剂量组，每100kg水中加入本品5g，1 d 2次，连用5 d；烟酸阿莫西林肌注高剂量组，20 mg/kg体重，1 d 2次，连用5 d；烟酸阿莫西林肌注中剂量组，15 mg/kg体重，1 d 2次，连用5 d；烟酸阿莫西林肌注低剂量组，10 mg/kg体重，1 d 2次，连用5 d；氨苄西林混饮组及氨苄西林肌注组，按说明书用量进行给药；感染对照组；另取18头健康猪作为健康对照组。用药前测量直肠温度并观察临床症状。

1.3 副猪嗜血杆菌病的诊断方法

1.3.1 诊断 根据流行病学调查、临诊症状、病理变化进行初步诊断，结合实验室检测进行确诊。

1.3.2 细菌分离、纯化 无菌采集5头病死猪（死前未用过抗生素、死亡不超过12 h）肺脏表面的纤维素性渗出物及心包液，接种于含50 mL/L犊牛血清和10 μg/mL NAD的TSA上，置5%CO2培养箱中37℃培养48 h后，取出培养基，观察菌落状态，挑取可疑菌落进行纯培养，观察菌落形态，革兰氏染色镜检。

1.3.3 卫星现象试验 挑取分离菌株单个菌落，水平划线于鲜血琼脂平板上、再挑取金黄色葡萄球菌垂直划线，置于5%CO2培养箱中37℃培养24～48 h后，观察是否有卫星生长现象、是否有溶血现象。

1.3.4 生化试验 挑取具有卫星生长现象且不溶血的单个菌落纯培养后接种于过氧化氢酶（触酶试验）、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、甘露醇、尿素酶等细菌生化微量鉴定管中，并在每只管中加入终浓度为40 μg/mL NAD，置于5%CO2培养箱中37℃培养24～48 h后，观察结果。

1.3.5 PCR鉴定（16S rRNA基因特异性检测）

（1）细菌基因组提取：取纯化后的单一菌落接种于含50 mL/L犊牛血清和10 μg/mL NAD的TSB液体培养液中，37℃振摇培养过夜。采用参照文献[3]的CTAB/NaCl方法提取细菌基因组DNA，干燥后溶于TE中-20℃保存，作为PCR扩增模板。

（2）引物设计及合成：参照文献[4]设计引物，引物序列为 P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′；P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，预期片段大小为822 bp，引物由上海生工合成。

（3）16S rRNA基因的PCR扩增：把提取的细菌DNA作为模板扩增16S rRNA基因。PCR反应体系为 25 μL：10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Tap 0.25 μL，上下游引物各 1.5 μL，模板 0.25 μL，用ddH2O补充至25 μL。反应条件为：95℃预变性 5 min，94℃变性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延伸10 min。结束反应后，取PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。1.3.6 血清型鉴定 按Kielstein-Rapp-Gabriedson（KRG）[5]琼脂扩散血清分型方法对分离的Hps菌株进行血清分型，Hps分型血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。

1.3.7 药敏试验 用纸片法检测细菌对药物的敏感度。将分离纯化的2株细菌，分别接种于含NAD及犊牛血清的TSA平板上培养24～48 h，用TSB洗脱，涡旋，稀释为0.5麦氏浑浊度，再均匀涂抹于TSA平板，贴上药敏纸片，置于5%CO2培养箱中37℃培养24～48 h后，测量抑菌圈大小。

1.4 评价指标

1.4.1 治愈率 试验期间，病猪用药后精神、食欲、体温、呼吸等恢复正常，临床症状消失，增重接近或超过健康对照组猪的比率。

1.4.2 有效率 试验期间，病猪用药后体温升高、呼吸困难、咳嗽等症状与健康对照组相比明显减轻或消失的猪的比率。

1.4.3 无效率 试验期间，病猪用药后临床症状与健康对照组相比未减轻或消失以及死亡的猪的比率。

1.5 数据分析处理

死亡率、有效率、治愈率用t检验法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 初步诊断

发病猪日龄为41～52 d。病猪主要表现为食欲下降、消瘦、被毛凌乱、精神沉郁、咳嗽、呼吸困难、腕关节及跗关节肿胀、跛行、共济失调、耳稍发紫、眼结膜发绀等症状。病死猪剖检可见多发性纤维素性浆膜炎和关节炎。胸腔、腹腔、心包腔、关节腔内有纤维素性或浆液纤维素性渗出物；肺表面有纤维素性渗出物，肺与胸腔发生粘连。心包增厚，心包上有大量纤维素附着，心包内有黄色积液。胸膜、腹膜、肝、脾及肠系膜表面可见浆液性和脓性纤维蛋白渗出物。可初步诊断为副猪嗜血杆菌病。

2.2 实验室检查

2.2.1 细菌分离、染色、镜检结果 将分离纯化的疑似细菌纯化培养48 h后，可见针尖大小、无色透明、湿润光滑的菌落。革兰氏染色后在显微镜下观察可见革兰氏阴性菌，呈短杆状、杆状、球状等多种形态。

2.2.2 卫星现象试验结果 呈现出明显的“卫星现象”，金黄色葡萄球菌双侧出现边缘整齐、针尖大小、圆形的菌落，离金黄色葡萄球菌越近菌落生长越好，越远菌落越小，甚至不见菌落生长。因金黄色葡萄球菌在生长过程中可合成V因子，并在培养基中扩散，所以出现这种现象；同时没有发生溶血现象。

2.2.3 生化试验结果 由表1可知，本菌脲酶阴性，氧化酶阴性，H2S、吲哚试验阴性，触酶阳性，硝酸盐还原试验阳性，发酵葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖，不发酵甘露醇、山梨醇、棉子糖。符合副猪嗜血杆菌的生理生化特性。

表1 生化试验结果

2.2.4 PCR鉴定结果 根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物，扩增后得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见目的片段处于750～1 000 bp之间，与预期PCR扩增产物片段822bp大小一致。

2.2.5 血清型鉴定结果 分离的2株副猪嗜血杆菌经血清型鉴定，得到4型1株、5型1株，表明分离株仍属我国目前的优势菌型4型及5型。

2.2.6 药敏试验结果 由表2可知，两株Hps分离菌株的药物敏感性基本一致，对恩诺沙星、红霉素、庆大霉素耐药，对环丙沙星、氟苯尼考中敏；对氨苄西林、头孢氨苄、利福平、烟酸阿莫西林高敏。

表2 药敏试验结果

2.2.7 治疗效果 感染对照组与健康对照组相比，病猪体温升高1～1.8℃，耳稍发紫、眼结膜发绀，精神沉郁，被毛粗乱，食欲不振或废绝，发病后2～3 d，出现咳嗽、呼吸困难、腕关节及跗关节肿胀、跛行、共济失调等症状。死亡8头，死亡率为44.4%。剖检病死猪可见多发性纤维素性浆膜炎和关节炎。胸腔、腹腔、心包腔、关节腔内有纤维素性或浆液纤维素性渗出物，伴有胸水、腹水及关节腔积液；肺表面有纤维素性渗出物，肺与胸腔发生粘连。心包增厚，心包上有大量纤维素附着，心包内有黄色积液。胸膜、腹膜、肝、脾及肠系膜表面可见浆液性和脓性纤维蛋白渗出物。

用药组与感染对照组相比，临床症状明显减轻，一般给药2～3 d后，多数猪的体温、食欲基本恢复正常。治疗效果见表3。由表3可知，烟酸阿莫西林组，混饮给药时死亡率达16.7%～22.2%、有效率达77.8%～83.3%、治愈率达61.1%～72.2%，肌肉注射时死亡率达5.6%～16.7%、有效率达83.3%～94.4%、治愈率达77.8%～94.4%；氨苄西林混饮给药时死亡率达16.7%、有效率达83.3%、治愈率达66.7%，肌肉注射时死亡率达5.6%、有效率达94.4%、治愈率达83.3%；由此可见治疗时肌肉注射比混饮给药效果要好。烟酸阿莫西林中、高剂量组肌肉注射死亡率、有效率均为5.6%、94.4%，高剂量治愈率94.4%，高于中剂量组88.9%。经t检验分析，烟酸阿莫西林中、高剂量肌肉注射组及氨苄西林肌肉注射组的死亡率均显著低于感染对照组（P＜0.05）；各治疗组之间死亡率、有效率、治愈率差异均不显著（P＞0.05）。表明临床治疗时，可选用氨苄西林或烟酸阿莫西林肌肉注射，1 d 2次，连用5 d，烟酸阿莫西林的剂量以15～20 mg/kg体重为宜。

表3 副猪嗜血杆菌病的药物治疗结果

3 讨论

副猪嗜血杆菌根据荚膜抗原的差异可分为至少15个血清型，约25%的分离株无法定型。不同血清型毒力存在较大差异，其中 1、5、10、12、13、14 型为高毒力株，可引起急性死亡；2、4、8、15型为中等毒力株，可引起浆膜炎和关节炎；血清 3、6、7、9 和11型为低毒力株，感染后猪没有明显临床症状[2]。虽然血清型与毒力存在一定关系，但同一血清型，毒力也不尽相同。各个血清型之间、同一血清型之间的交叉保护力存在差异，故疫苗不能很好地预防此病[6]。近年来关于此病的报道[7-12]屡见不鲜，给养殖户造成了严重的经济损失。本项目中分离的副猪嗜血杆菌1株为高毒力，1株为中等毒力，用烟酸阿莫西林可溶性粉治疗后，中、高剂量组肌肉注射的有效率为94.4%，高于混饮的有效率83.3%。临床用于治疗时建议肌肉注射，15～20 mg/kg体重，1 d 2次，连用5 d，以便尽早控制病情，减少损失。对于受副猪嗜血杆菌病威胁的猪群，可混饮给药以降低发病率和死亡率。

使用抗生素是目前治疗和控制副猪嗜血杆菌病的主要措施。但是抗菌药物长期、广泛和不合理使用及抗菌药物的选择压力等势必导致耐药菌株的不断增多，耐药谱日益扩大[13]。建议用药前先进行药敏试验，选用敏感药物定期轮换使用，以最大限度地降低其耐药性。遇天气骤变、长途运输等应激时猪易发生副猪嗜血杆菌病，平时应当加强饲养管理，改善猪舍环境，减少应激。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定是本病的一种可靠诊断方法，分离副猪嗜血杆菌时必须注意以下几点：病料不能采自使用过抗生素治疗的猪；猪死亡时间不能超过12 h；病料必须是新鲜的组织，不能冻存；采集的病料在4～6 h冷藏条件下送实验室；培养基中必须加入NAD和犊牛血清，否则分离率大幅降低。PCR检测时用组织直接检测，敏感度略低，可直接使用分离和纯化的细菌、液体培养的菌液或纤维素性渗出物。

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