大豆异黄酮对阿特拉津损伤SH-SY5Y细胞的保护作用及其机制

李 鹏 ，马 焜，吴浩宇，

吴艳萍，李百祥*

（哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，黑龙江 哈 尔滨 150081）

阿特拉津(atrazine，ATR)是一种含氯的均三氮苯类除草剂。其价格低廉、低毒且除草效果好而被世界广泛应用。可在地表或地下水中富集，通过食物链蓄积，对机体多个脏器产生不同程度的损害，包括生殖系统、免疫系统和中枢神经系统，具有致癌、致畸和内分泌干扰性[1-5]。就其神经毒性而言，表现为纹状体多巴胺(dopamine，DA)含量降低，黑质致密区酪氨酸脱氢酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性细胞减少，引起机体出现类似帕金森(Parkinson，PD)的病理和行为表现[6-7]。研究表明，ATR致DA神经系统的损伤主要是通过诱发氧化应激，提高活性氧浓度[8]，而天然植物化合物具有抗氧化、抗炎的作用。已有研究表明大豆异黄酮、槲皮素、茶多酚、姜黄素和白藜芦醇可以抑制神经细胞凋亡[9-13]。因此本研究通过体外实验，选取人神经胶质母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞，神经细胞的一种)，对其进行培养，比较大豆异黄酮、槲皮素、茶多酚、姜黄素和白藜芦醇5种植物化合物抗ATR的DA 神经元损伤作用，为有效预防和治疗PD药物开发及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 人神经胶质母细胞瘤SH-SY5Y细胞株，购自北京协和细胞资源中心。

1.1.2 试剂与仪器 阿特拉津(CAS号1912-24-9，99.7%，南京都莱生物技术有限公司)；DMEM高糖培养液，购于美国Gibco公司；青霉素，链霉素购于哈药集团；胎牛血清购于以色列Beit-Haemek公司；胰蛋白酶购于南京碧云天公司；CCK-8购于日本Dojindo公司；BCA蛋白检测试剂盒购于南京碧云天公司；大豆异黄酮、槲皮素、白藜芦醇、茶多酚购于北京标准品物质中心；姜黄素购于美国Sigma公司；抗-TH多克隆抗体购于美国Santa公司；β-actin购于美国Immuno Way公司；碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于美国Invitrogen公司；活性氧检测试剂盒购于南京白云天公司；超净工作台购于苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱购于美国Thermo公司；低温高速离心机购于德国HERMLE公司；酶联免疫检测仪购于美国Bio-Rad公司；凝胶图像分析仪购于美国Gold-SIM公司；流式细胞分析仪购于美国BD公司；激光扫描共聚焦显微镜购于日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SH-SY5Y细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中。在37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的培养箱中培养，取对数期生长良好的细胞进行实验。

1.2.2 细胞活力检测 在前期研究中，已经证明ATR以时间和剂量依赖的方式降低SH-SY5Y细胞的活力，ATR染毒的细胞在24 h的半数致死量(LD50)为250µmol/L[12]，在本研究中，使用250 µmol/L ATR作进一步的研究。取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，在无菌96孔培养板中按每孔100 µL加入细胞悬浮液，37 ℃孵箱中培养24 h后，弃去培养基，分别加入含大豆异黄酮、槲皮素、白藜芦醇、茶多酚、姜黄素的培养液，各植物化合物的浓度梯度均为5、10、20、50、100 µmol/L。培养24 h后，弃培养基，用PBS洗3次，加入浓度为250 µmol/L的ATR培养液。另设ATR组(含250 µmol/L ATR的细胞培养液100 µL于细胞培养48 h后加入)，对照组(细胞培养液100 µL)，每组设9个复孔。培养24 h后，吸弃培养液，每孔加入含10µL C CK-8的细胞培养液，培养2 h 后，用酶标仪检测波长的吸光度D(450)值。

细胞相对活力(%)=[(D(450)对照孔- D(450)实验孔) /(D(450)对照孔-D(450)空白孔)]×100%

实验孔：含有细胞的培养液、CCK-8、药物；对照孔：含有细胞的培养液、CCK-8、不含药物；空白孔：不含细胞和药物的培养液、CCK-8。

1.2.3 细胞凋亡检测 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于6孔板培养，每孔含细胞悬浮液2 mL。细胞分组和处理同1.2.2。培养24 h后收集细胞，PBS洗2次，PBS重新悬浮细胞并计数，取含5×105/mL的细胞悬液，1 000 r/min离心5 min后弃上清液，加入500 µL的结合缓冲液悬浮细胞，加入5 µL Annexin V-FITC混匀后，加入5 µL碘化丙啶(PI)，混匀，室温、避光反应15 min，用流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1.2.4 活性氧自由基(ROS)的检测 根据CCK-8实验、细胞凋亡实验结果，5 µmol/L大豆异黄酮对ATR 损伤SH-SY5Y细胞的保护效果最好，故选取5 µmol/L大豆异黄酮作进一步研究。取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于24孔板(板内含有直径1 cm的圆形盖玻片)，每孔含细胞悬液0.5 mL。37 ℃孵箱中培养24 h后，弃去培养基，加入5 µmol/L大豆异黄酮培养液，培养24 h，弃掉培养基，用PBS洗3次，加入浓度为250 µmol/L的ATR培养液。另设ATR组(含250µmol/L ATR的细胞培养液)，空白对照组(不经任何处理的细胞组)。培养24 h后，弃去原有培养液，加入含有DAPI的PBS 1 mL，37 ℃孵箱中孵育30 min，PBS洗3次，加入含有10 µmol/L DCFH-DA探针的无血清细胞培养液1 mL，37 ℃孵箱中孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤3次，以充分除去未进入细胞的DCFHDA。用镊子夹取圆形盖玻片倒放在载玻片上，适当风干后，封片，激光共聚焦显微镜下观察荧光标记的细胞并拍照。

1.2.5 Western blot法检测TH蛋白的表达 取对数生长期的细胞，接种于细胞培养瓶中进行培养，24 h后，加入含浓度为5 µmol/L大豆异黄酮的细胞培养液，培养24 h后，弃掉培养基，用PBS洗3次，加入浓度为250 µmol/L的ATR培养液，培养24 h后、收集细胞，加蛋白裂解液、低温高速离心机收集蛋白，用BCA测定蛋白浓度，计算蛋白加样量。进行Western blot实验，步骤简述如下：凝胶垂直放置于室温下，待基层胶聚合完全(20～30 min)，加入分离胶，插入梳子待其凝固，移出梳子。将凝胶板置于电泳装置上，加入电泳液进行电泳(80 V，20 min；120 V，60 min)。当marker充分分离后，关闭电源，将蛋白转至PVDF膜上，58 V恒压转膜，4 ℃，70 min。转膜后与一抗反应，4 ℃过夜。第2天将PVDF膜取出，TBST洗膜3次，每次5 min，与碱性磷酸酶标记的二抗摇床孵育1 h，TBST洗膜2次，每次5 min，TBS洗膜1次，每次5 min。显影，将蛋白图像扫描到电脑上，通过Licor-odyssey软件进行定量分析，结果以蛋白的相对量表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞活力检测

CCK-8法检测大豆异黄酮、槲皮素、白藜芦醇、茶多酚、姜黄素5种植物化合物对ATR作用下的SHSY5Y细胞活力，结果见图1。与对照组(100%)相比，ATR组细胞相对活力为43.57%±7.95%。与ATR组相比，白藜芦醇在5 µmol/L、槲皮素在50 µmol/L、姜黄素在5 µmol/L、茶多酚在20 µmol/L、大豆异黄酮在5µmol/L处可显著提高细胞相对活力(P＜0.05)。大豆异黄酮在5～100 µmol/L范围内细胞活力随剂量增加逐渐降低，但在同一剂量下均高于ATR组和其他4种植物化合物组，在5 µmol/L处细胞活力最高，细胞相对活力为81.47%±4.75%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图1 5种植物化合物对ATR作用下的SH-SY5Y细胞活力的影响

2.2 细胞凋亡检测

流式细胞术检测结果见表2，可见与对照组相比，ATR组细胞凋亡率为19.83%±1.81%。与ATR组相比，白藜芦醇在10 µmol/L、槲皮素在50 µmol/L、姜黄素在5 µmol/L、茶多酚在20 µmol/L、大豆异黄酮在5µmol/L处可显著抑制细胞凋亡，差异有统计学意义(P＜0.05)。总体而言，5种植物化合物在低剂量范围内可有效减少ATR对SH-SY5Y细胞的损伤，在5 µmol/L处，姜黄素和大豆异黄酮效果最好，但是大豆异黄酮相比姜黄素而言，制作成本低且原材料丰富易获取。故选取5 µmol/L大豆异黄酮作进一步的实验。

图2 5种植物化合物对ATR作用下的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

2.3 细胞内ROS检测

激光共聚焦显微镜观察结果见图3，可见经250µmol/L ATR染毒后24 h，SH-SY5Y细胞内ROS的荧光强度明显增加。5 µmol/L大豆异黄酮预培养24 h，细胞内ROS的荧光强度减弱。说明大豆异黄酮可拮抗ATR，减少细胞内ROS的生成。

2.4 Western blot检测细胞内TH的表达量

Western blot检测结果见图4。通过Licor-odyssey软件定量分析，250 µmol/L ATR染毒后24 h，与空白组比较，SH-SY5Y细胞内TH蛋白的表达量下降，经5µmol/L大豆异黄酮提前处理24 h，可增加细胞内TH蛋白的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而大豆异黄酮与ATR联合组的TH表达量与空白组相当(P＞0.05)，说明大豆异黄酮可减轻ATR对SH-SY5Y细胞的损伤。

图3 5 µmol/L大豆异黄酮和ATR处理24 h后对SH-SY5Y细胞内ROS的影响

图4 5 µmol/L大豆异黄酮和ATR处理24 h后对SH-SY5Y细胞内TH表达量的影响

3 讨论

阿特拉津作为一种广泛使用的含氯均三氮苯类除草剂，化学结构稳定，不易降解，可通过生物蓄积增加人类接触的危险性。所以在农业生产方面，大面积使用ATR，用于杀灭杂草的同时，也对粮食和食品构成了潜在的威胁，增加了人体接触的机会，造成不易察觉的亚急性或慢性损害。研究发现，ATR具有神经毒性，可以干扰突触小泡与突触体的相互作用，影响突触小泡存储和摄取多巴胺，导致神经退行性疾病[14-16]，如PD。同时ATR可剂量依赖性的减少纹状体内多巴胺及其代谢产物的水平并减少酪氨酸羟化酶阳性多巴胺神经元的数目[17-18]。因此寻找副作用小、能够有效预防及改善ATR对多巴胺能神经损伤的药物，了解其机制，成为研究热点。研究表明大豆异黄酮、槲皮素、白藜芦醇、茶多酚、姜黄素5种植物化合物具有神经保护作用，为了比较5种植物化合物对ATR所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，在本研究中，我们选用CCK-8实验和流式细胞实验分别检测细胞活力和细胞凋亡率。结果表明，5种植物化合物在低剂量范围内，可以有效的减少ATR对SH-SY5Y细胞的损伤，相比较其他4种植物化合物而言，大豆异黄酮可以显著增加SH-SY5Y细胞的活力，抑制细胞凋亡，尤其在5 µmol/L处，效果最佳。

神经细胞死亡且不可再生，造成细胞死亡的主要原因之一是氧化应激，产生大量的ROS，ROS 通过激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)信号通路，诱导细胞凋亡，也可导致呼吸链受损，减少ATP的产生，进一步增加ROS，降低线粒体膜电位，导致促凋亡蛋白Bax的激活和细胞色素C的释放[19-21]。 Ma等[8]的研究表明ATR通过诱导小胶质细胞的活化增加ROS的表达，从而增加其对SH-SY5Y细胞的损伤。Astrid等[10]的研究表明大豆异黄酮可以减少β-淀粉样蛋白在转基因线虫中造成的氧化应激。本研究结果表明，ATR可以增加细胞内ROS的表达水平，大豆异黄酮可以抗ATR减少细胞内ROS的生成，说明大豆异黄酮可以减少ATR引起的氧化应激损伤。

TH作为多巴胺合成的限速酶，在多巴胺合成的调节过程中起着重要的作用。马琨等[22]的研究表明ATR对大鼠黑质区DA能神经元有明显的损伤作用，可以减少黑质区TH的表达。本研究结果表明，ATR可以减少TH的表达，大豆异黄酮可以拮抗ATR增加TH的表达，说明大豆异黄酮可以有效的减少ATR引起的DA能神经元的损伤死亡。

综上所述，5种植物化合物中，大豆异黄酮抗ATR，对SH-SY5Y细胞的保护效果最好且能有效减少细胞内ROS的产生，增加TH的表达。为寻找有效的神经保护药物提供依据，为PD的预防指明了方向。

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中国环境诱变剂学会举行第7次全国会员代表大会暨第17次学术大会

中国环境诱变剂学会第7次全国会员代表大会暨第17次学术大会于2017年12月6—8日在上海举行，来自全国各地近四百位会员代表出席了大会。

学术大会以“环境诱变剂与人群健康和疾病”为主题，通过主会场、分会场和墙报交流的形式，展示了我国相关领域的最新研究成果，使参会代表了解到国内外的研究进展和发展动向。有12名学者获青年优秀论文奖，8名学者获优秀壁报奖。本次学术大会为推进后备人才的成长，促进我国在环境诱变剂与人群健康和疾病领域的研究发展，更好地发挥学会服务国家和社会的功能作出了贡献。

12月8日下午第7次全国会员代表大会举行，学会副理事长兼秘书长郝卫东教授代表第6届理事会作了工作报告。报告指出，中国环境诱变剂学会第6届理事会于2012年11月经会员代表大会选举产生，历时5年。5年中，在中国科协的全面指导下、在挂靠单位北大医学部的支持下、在理事会和广大会员的积极参与下，学会在组织建设、学术交流、期刊出版、科普宣传、人才队伍建设等方面得到持续、稳定、健康的发展，已成为发展和壮大我国环境诱变剂领域研究，推动我国经济、环境与社会可持续发展的重要力量。

大会通过了学会第6届理事会工作报告、学会章程修改报告、学会财务工作报告、监事会工作条例。会议以无记名投票方式，选举产生了第7届理事会、第1届监事会。随后召开了第7届理事会第1次会议，选举产生了常务理事会及学会领导人，通过了学会名誉理事长提名。第7届理事会理事长曹佳教授聘任郝卫东教授为学会秘书长，郝卫东秘书长确定了副秘书长人选。会议还选举产生了新的中国环境诱变剂学会党委。

第7届理事会理事长曹佳教授代表学会领导班子表示，感谢全体理事的信任。党的十九大对广大科学工作者提出了更高的要求，也提供了更加广阔的舞台。让我们认真学习和贯彻习近平新时代中国特色社会主义思想，努力开创学会工作的新局面。