猴头多糖提取鉴定及抗肿瘤作用的研究进展

石祥生，于　涛

(东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心/东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨　150040)

目前，癌症是危害人类健康的重大疾病之一，近年来癌症发病率逐步增长且死亡率极高。化疗是癌症治疗的重要手段之一，但多数化疗药物对肿瘤细胞缺乏特异性，在治疗肿瘤的同时会损伤正常组织进而产生严重的毒副作用[1-2]。人体的免疫耐受及免疫抑制反应是肿瘤发生和生长的重要原因之一，增强肿瘤免疫功能已经成为一种对宿主无害的癌症治疗新策略[3]。多糖是由10个及以上单糖通过糖苷键结合形成的高分子碳水化合物，在自然界中分布广泛。研究表明，多糖能通过产生细胞毒性及提高宿主机体免疫应答等方式达到抗肿瘤作用[4-7]。目前，菌菇多糖由于具有显著抗肿瘤作用在医药领域引起了广泛关注。

猴头菌(Hericiumerinaceus)又名猴菇，是一种常见食用菌。猴头菌富含多种生物活性物质，其中多糖成分最具药用价值。研究显示，猴头多糖具有治疗胃溃疡、降血压、降血糖、降血脂、抗氧化及保护神经的作用[8-11]。近些年，多项研究表明，猴头菇中的多糖成分具有显著的抗肿瘤活性。本文将对猴头菇多糖的提取鉴定技术、抗肿瘤活性及其机制的研究进行综述和总结。

1　猴头多糖的分离纯化及结构鉴定研究

猴头多糖的提取方法主要有热水浸提法、稀酸稀碱提取法、酶辅助提取法、超声及微波辅助提取法。通过上述方法提取的多糖通常含有杂质，需进行纯化除杂。纯化的主要目的是去除多余的蛋白(主要方法有Sevage法、三氯乙酸法、蛋白酶法)和小分子杂质(主要方法有透析、超滤、反渗透法)，颜色较深的多糖提取物还需脱色(主要方法有活性炭法、大孔树脂吸附法、过氧化氢法)。运用色谱技术将多糖分级纯化是多糖除杂后的重要过程，需通过纤维素柱色谱、离子交换层析、凝胶渗透色谱等方法将混合多糖分成若干组分。纯化后的多糖还需对纯度、平均分子量、单糖组分、糖苷键键型、连接方式及结构等特征进行测定，运用的方法主要有高效液相色谱、甲基化分析、Smith降解、部分酸水解、气相质谱法、红外光谱法、核磁共振分析等。

杨勇杰等[12]利用传统的水提醇沉法从猴头中提取得到混合多糖HEP，又利用Sephadex G150凝胶柱层析从HEP中分离得到组分HEP-2。通过有机元素分析、红外光谱分析、电感耦合等离子体原子发射光谱分析(ICP-AES)等多种分析方法确定HEP-2的化学组分有多糖(62.52%)、蛋白(7.49%)、硫酸基(18.50%)和金属离子(12.64%)，初步确定HEP-2是一种含蛋白质和硫酸基的硫酸酯多糖。Wang等[13]用热水提取和乙醇沉淀法从猴头子实体中提取了水溶性的混合多糖HP，然后利用DEAE琼脂糖凝胶和CL-6B柱色谱分级得到2个多糖组分HPA和HPB，通过甲基化和气相色谱-质谱联用分析、红外光谱分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解的方法确定了两个组分的单糖组成和化学结构。结果显示，两者均含β-糖苷键，HPA的单糖组成为葡萄糖、半乳糖、岩藻糖，摩尔比为1∶2.110∶0.423。HPB的单糖组成为半乳糖和葡萄糖，摩尔比为1∶11.529。张金亭等[14]从小刺猴头中提取出粗多糖，利用DEAE-Sepharose CL-6B和葡聚糖 Sephadex G-100柱色谱进一步分离纯化出多糖组分HP1，检测其平均相对分子质量为65 000 Da，用气相色谱和纸色谱分析其单糖组成为岩藻糖、葡萄糖、半乳糖，摩尔比为0.423∶1∶2.110，红外光谱结果显示，HP1是以β-糖苷键为主的中性杂多糖。Zhang等[15]从猴头子实体中分离得到一种新型的杂多糖HEPF3，HEPF3的平均相对分子质量为 1.9×104Da，是由海藻糖和半乳糖以 1∶4.12的摩尔比组成，经过组成成分分析、甲基化分析、1H和13C核磁共振分析确定HEPF3是由一个含戊多糖重复单元的高分子主链和较小比例的 3-O-甲基化鼠李糖分支组成。

2　猴头多糖抗肿瘤活性与机制的研究

2.1　猴头多糖体外抗癌活性及机制

猴头多糖在体外对肿瘤细胞并无抑制活性，但从猴头深层发酵液中提取到的糖类物质对一些种类的癌症细胞具有生长抑制活性，主要机制是阻滞细胞周期的某阶段从而抑制细胞的增值。苏玲等[16]从小刺猴头菌液体深层发酵浸膏中提取出两个组分的糖类，大分子糖组分(HFP)和小分子糖组分(HFA)，之后分别对两个糖组分进行体外抗肿瘤试验，利用MTT法观察不同浓度(15.625～2 000μg/mL)的HFP和HFA对人肝癌细胞SMMC7721、人肺腺癌细胞SPC-a-1、人胃癌细胞SGC7901三种肿瘤细胞系的增殖抑制活性。结果显示，HFP和HFA对SMMC7721、SPC-a-1、SGC7901 均有增殖抑制活性，且基本呈剂量依赖关系，在药物浓度大于250μg/mL的时候抑制率明显；研究发现，HFP的作用效果好于 HFA，抑制率最高能达到70.5%。王雪等[17]从小刺猴头的液体深层发酵浸膏中提取到多个多糖组分，利用MTT法初步筛选出在体外对Hela细胞增殖抑制率最高的组分Hep2，其机制是通过对癌细胞细胞周期的S 期和 G2/M 期进行阻滞从而抑制其生长，并将Hep2与临床化疗药物5-Fu联用在体外对Hela细胞进行增殖抑制试验，证明猴头多糖可以与化疗药物协同作用在体外抑制Hela细胞的增值。

2.2　猴头多糖体内抗癌活性及机制

研究表明，猴头多糖在体内的抗癌活性通常和免疫及细胞凋亡途径相关，其主要机制是通过对机体进行免疫调节，降低肿瘤组织血管内皮细胞生长因子(VEGF)的水平，以及诱发细胞凋亡，而抑制肿瘤的生长。

Wang等[18]在猴头和H.伞状蘑菇的发酵浸膏培养液中提取了多糖成分，在ICR小鼠体内进行抗肿瘤和免疫活性研究。结果表明，两种多糖都具有显著的抗人造肺转移性肿瘤的作用，相比之下，从猴头菇中提取的多糖比从H.伞状蘑菇中提取的多糖更有效。进一步研究表明，多糖可以增强T细胞和巨噬细胞的增值，在试验组中CD4+细胞和巨噬细胞的数量均显著高于对照组。Liu等[19]研究表明，猴头多糖和香菇多糖均对荷瘤小鼠S180肉瘤具有抗肿瘤活性和免疫调节作用。在Lee等[20]的实验研究中，从猴头中提取的水溶性粗多糖可以通过激活巨噬细胞来上调免疫调节功能，如一氧化氮(NO)的产生和细胞因子(IL-1β和TNF-β)的表达。夏松柏等[21]利用小鼠建立S180肉瘤模型，以灌胃方式给予猴头多糖并分离血清，结果显示，给药组均有一定的抑瘤率，通过检测发现多糖给药组血清中两种细胞因子 IFN-γ和IL-2 的水平均高于对照组，表明猴头多糖可以促进IFN-γ和IL-2的分泌，通过提高机体的免疫机能进而产生肿瘤抑制作用。具振瑶等[22]研究表明，猴头多糖可以提高S180荷瘤小鼠血清中IFN-γ和IL-2的水平，从而增强免疫功能，并且降低VEGF水平。彭瀛等[23]研究表明，猴头多糖对H22肝癌移植瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长均有抑制作用，多糖给药组小鼠的体重有增加趋势，血清中细胞因子IL-2、TNF-α的水平有所提高，VEGF含量降低，其机制与调节机体的免疫相关功能并降低肿瘤组织血管内皮细胞生长因子的生成有关。

Lee等[24]研究发现，协同使用猴头多糖和阿霉素(Dox)可有效诱导HepG2肝癌细胞的凋亡，其中多糖可以作为阿霉素(Dox)-介导的细胞凋亡信号的增敏剂，并且这种增敏作用还能活化c-Jun N末端激酶(JNK)，降低c-FLIP的表达，也可以通过抑制HepG2细胞中的核因子(NF)-κB活性来增强细胞内Dox的积累，能实现更好的协同抑制作用。于子雯等[25]研究表明，服用猴头多糖能提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数，下调肿瘤细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2表达的水平，上调促凋亡蛋白Bax的表达水平，从而加速肿瘤细胞的凋亡。姜颖等[26]建立小鼠S180肉瘤模型，以灌胃方式给予猴头多糖，高中低剂量给药组均有一定的抑瘤率，并运用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况及免疫组化法检测肉瘤组织的 Caspase-3 蛋白表达情况，结果显示，猴头多糖可以提高Caspase-3 蛋白的表达水平，从而促进肉瘤细胞的凋亡。

3　前景与展望

癌症是目前危害人类健康的一类重大疾病，基于目前的放疗、化疗等常规癌症治疗方法对机体的毒副作用过大，寻找天然安全的有抗癌功效的生物活性物质已成为研究热点，菌类多糖便是其中之一。因猴头类多糖已被多次报道有抗肿瘤活性，本文综述了近年来国内外关于猴头类多糖的提取鉴定及抗癌活性的相关研究。虽然已经证明猴头多糖对部分肿瘤有抑制活性，且有初步的抗癌机理的探究，但仍存在一些需要解决的问题。比如目前进行大量的多糖纯化及结构解析的研究，因为猴头菇种类不同，分离纯化的过程和方法不同，导致分级结构及表征结果均有不同，多糖抗癌活性及其分子构效关系的阐述仍不深入，未能准确判断多糖混合物及不同的纯化组分的活性机理的异同等，这些问题严重限制了多糖类活性物质的开发生产和活性机制的研究。今后的研究方向应考虑从细胞、分子及基因水平深入探究猴头多糖的抗癌机制，准确筛选并分析鉴定有抗癌活性的多糖高级结构，这有利于大批量工业化生产多糖药物并应用于临床，使其为人类的抗癌事业做出巨大的贡献。◇

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