柚子皮中的总黄酮提取工艺研究

郑培君+程海涛+王小博

摘要：以乙醇作为浸提剂，利用响应曲面法探讨柚子皮总黄酮的最佳提取工艺条件。结果表明，提取温度为70 ℃，液料比为20∶1（mL∶g）、乙醇体积分数为80%、提取时间为1.5 h，所得的柚子皮中的总黄酮含量最高，为0.864%。

关键词：柚子皮；响应曲面法；总黄酮；提取工艺

中图分类号：S666.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）01-0104-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.027

Abstract： The optimum extracting parameters were investigated with response surface methodology with alcohol as the extraction agent. The results showed that the extracting rate of total flavonoids reached 0.864% at the optimal processing conditions when extraction temperature was 70 ℃，the ratio of extractant to material was 20∶1（mL∶g），volume percent of alcohol was 80%，and extraction time was 1.5 h.

Key words： pommel peel；response surface methodology；total flavonoids；extract process

黃酮类化合物是一类具有C6C3C6骨架的2-苯基色原酮或色原烷的衍生物[1]。柚子皮中含有丰富的黄酮类物质，通常在植物中与糖结合成苷，主要由柚皮苷、橙皮苷、柚皮素芸香苷等二氢黄酮类化合物构成，其中柚皮苷含量占80%以上[2]。黄酮类化合物具有多种生物活性和药用价值，如抗氧化、抗肿瘤、消炎、镇痛、抗菌、降低血液黏度、减少血脂和血栓的形成、防治胃溃疡等[3-6]。在食品工业上，可作为天然的食品添加剂、食用色素、风味改良剂和苦味剂[7]，又可合成高甜度、无毒、低能量的柚皮苷二氢查尔酮和新橙皮甙二氢查尔酮。此外，柚皮苷还可以用作合成柠檬素、鼠李糖等具有较高的药用价值的原材料[8]。长期以来，柚子主要用来鲜食，而占柚果总重量高达20%～30%的果皮，大多数作为废物被丢弃，既浪费资源又污染环境。从柚子皮中提取黄酮类物质可以有效开发利用柚子资源，对提高柚子产业的附加值具有重要意义。本研究应用乙醇浸提法，通过单因素试验和响应面优化，得出了柚子皮总黄酮提取的最佳工艺参数，以期为柚子产业开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 马家柚，由江西瀛洲农业科技发展有限公司提供。芦丁标准品（生化试剂），乙醇、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯甲烷（均为分析纯），均购自广州齐云化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备 HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市华城开元实验仪器厂）；722 N型可见分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）；SHZ-CB型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；JJ200 B型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；RV 10型旋转蒸发器（德国IKA集团）。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品15.0 mg，加甲醇溶解并定容100 mL，得到浓度为150 μg/mL的芦丁标准溶液。分别准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入10 mL具塞刻度试管中，先加30%乙醇溶液至5 mL，再加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min，加入10%Al（OH）3溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min，再加入1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，再用30%乙醇溶液定容至刻度，充分振荡后放置30 min。以30%乙醇为空白，用1 cm比色杯在波长510 nm下测定吸光度[9]。

1.2.2 黄酮类物质的提取 将柚子清洗除杂后，剥取其果皮，柚子皮经过挑选清洗，切割成1 cm2的小块，置于70 ℃的烘箱中干燥10 h，用小型高速粉碎机将其粉碎过100目筛。精确称取2.5 g制备好的柚皮粉，置于锥形瓶中。按照张怡等[10]的方法提取后作为待测液。

1.2.3 总黄酮的检测 用移液管吸取1 mL待测液，按标准曲线指标操作步骤于波长510 nm处进行吸光度测定。通过吸光度的测定，根据以下公式算出样品中总黄酮提取率[10]。重复3次，取平均值。

总黄酮提取率：X=（M1V2/MV1）×10-6。式中，M1为依据标准曲线计算出被测液中总黄酮的含量（μg）；M为试样的质量（g）；V1为待测液分取的体积（mL）；V2为待测液的总体积（mL）。

1.2.4 单因素试验

1）提取温度的选择。固定液料比为20∶1（mL∶g，下同），乙醇体积分数为70%，提取时间为2 h的提取条件下，在提取温度为60、70、80、90、100 ℃时，测定柚子皮中的总黄酮提取率。

2）液料比的选择。固定提取温度为70 ℃，乙醇体积分数为70%，提取时间为2 h的提取条件下，液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL∶g，下同）时，测定柚子皮中的总黄酮提取率。

3）乙醇体积分数的选择。固定提取温度为70 ℃，液料比为20∶1，提取时间为2 h的提取条件下，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%时，测定柚子皮中的总黄酮提取率。endprint

4）提取时间的选择。固定提取温度为70 ℃，乙醇体积分数为70%，液料比为20∶1的提取条件下，提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h时，测定柚子皮中的总黄酮提取率。

1.2.5 响应面优化 在单因素试验结果基础上，采用Design-Expert 8.06软件的Box-Behnken设计原则设计试验，并对提取条件进行优化。选取提取温度、液料比、乙醇体积分数、提取时间4个因素作为试验因素，总黄酮提取率为响应值。

1.3 数据统计分析

采用SPSS19.0软件对试验数据进行统计分析，采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对柚子皮总黄酮提取率的影响 由图1可知，在70 ℃，柚子皮总黄酮提取率最高，当温度大于70 ℃时，提取率反而呈下降趋势。这是因为随着温度的增加，可溶性成分的溶解度和扩散系数增大，有利于浸提；但过高的温度，会破坏不耐热的活性成分，降低柚子皮总黄酮的提取率；此外，温度较高时乙醇挥发严重，也会降低总黄酮提取率[11]。因此，初步确定70 ℃为最佳的浸提温度。

2.1.2 液料比对柚子皮总黄酮提取率的影响 由图2可以看出，随着液料比的增大，总黄酮提取率增加，20∶1时最大。这是因为随着溶剂的增多，增加了柚子皮粉与溶剂的接触面积，提高了传质效率[11]。但当液料比大于20∶1时，总黄酮提取率反而略有下降。这可能是因为，料液浸提法是一种传质扩散的过程，当增加溶剂用量时，提取时间也需要延长，因此在限定的时间内提取率会稍有下降[12]。此外液料比过大，不利于浓缩回收，还增加能耗，考虑到节约成本，确定液料比为20∶1。

2.1.3 乙醇体积分数对柚子皮总黄酮提取率的影响 黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂。考虑溶剂的安全性及有效性，本研究选用乙醇作为浸提剂。乙醇作为浸提剂，具有渗透性强、提取效率高、选择性好等优点，且黄酮类化合物具有酚羟基在水中有一定的溶解度[13]。由此，确定使用乙醇水溶液作为提取溶剂。由图3可知，柚子皮中的总黄酮得率随乙醇体积分数的增加而升高，这可能是由于乙醇体积分数的增加，减少了柚子皮与溶剂间黄酮类化合物的浓度差，从而增加了柚子皮中总黄酮提取效率，而且随着乙醇体积分数增大，部分脂溶性黄酮一并提取，所以吸光度和黄酮得率在不断增大[14]。乙醇体积分数达到70%时，提取率最高，而后反而下降。这可能是由于乙醇体积分数过高时，乙醇大量挥发，同时增加了一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强成分的溶出，与黄酮类化合物竞争与乙醇结合，且乙醇体积分数过高降低了水溶性黄酮的溶解度，从而导致总黄酮提取率的下降[11]。因此，确定乙醇体积分数为70%。

2.1.4 提取时间对柚子皮总黄酮提取率的影响 由图4可知，柚子皮总黄酮的提取率随时间的增加而快速增加，2.0 h达到最高；此后随着时间的延长，总黄酮提取率反而略有下降，究其原因可能是提取时间太长，部分乙醇挥发导致沸点增大，提取液中对热敏感的黄酮类化合物发生水解[15]，进而影响柚子皮总黄酮提取率。因此，为使浸提充分又节约能耗，初步确定提取时间为2.0 h。

2.2 响应面分析

由单因素试验结果可以看出，柚子皮总黄酮的提取效果取决于提取温度、液料比、乙醇体积分数、提取时间的选择以及各提取条件间的相互组合[16]。采用响应面法优化柚子皮总黄酮的提取条件，在单因素试验的基础上，以提取温度、液料比、乙醇体积分数、提取时间为自变量，总黄酮提取率为响应值，采用Design Expert 8.06软件根据Box-Behnken设计原则设计试验，并对所得数据进行分析（表1）。

2.1.1 拟合模型 根据Box-Behnken设计原则，Design Expert 8.06软件设计了29组试验（表2），被用于优化提取条件。采用方差分析（ANOVA），二阶多项式模型来计算预测的响应，公式如下：

Y=0.82+5.18×10-3A-9.2×10-3B+0.026C-0.027D+2.53×10-3AB-1.75×10-3AC+3.25×10-3AD+5.03×10-3BC-0.011BD-5×10-4CD-0.057A2-0.053B2+0.027C2+7.517×10-3D2。

式中，Y表示总黄酮提取率，A表示提取温度，B表示液料比，C表示乙醇体积分数，D表示提取时间。其中，R2=0.998 6，表明方程可信度较好，能够准确地分析和预测黄酮的提取条件。

采用F检验、P值来评价模型方程的统计学意义，F值和P值用来检验每个系数的显著性。F越大，P值越小，则相应的系数越显著。根据方差分析结果（表3），模型的F为698.65，P<0.000 1，这表明模型极显著。系数A、B、C、D、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均显著（P<0.05），其他系数并不显著（P>0.05）。此外，失拟项F为1.22，P=0.459>0.05，说明了失拟性误差不显著。决定系数（R2=0.998 6）的值接近于1，表明预测值与实际值具有有效的关联性。调整后的决定系数（R2adj=0.997 1）也接近1，这表明试验值可以由模型来预测。

2.1.2 响应面分析 响应面模型是表达不同参数对总黄酮提取效果的最好方式。三维（3D）响应面作为回归方程的一个重要组成部分，可以描述两个变量之间的相互作用，并确定它们的最优水平。它提供了一个有效的方法来反映响应值与各变量试验水平间的关系及两个变量间相互作用的类型。图的形状可以反应变量之间的相互作用是否显著[17]。图5显示提取温度、液料比、乙醇体积分数、提取时间之间的相互作用对总黄酮提取率的影响。结合方差分析，可以知道提取温度-液料比之間的相互作用对总黄酮提取率影响显著（图5-A）；乙醇体积分数-提取温度之间的相互作用对总黄酮提取率影响显著（图5-B）；提取时间-温度之间的相互作用对总黄酮提取率影响显著（图5-C）；乙醇体积分数-液料比之间的相互作用对总黄酮提取率影响显著（图5-D）；提取时间-液料比之间的相互作用对总黄酮提取率影响显著（图5-E）；提取时间-乙醇体积分数之间的相互作用对总黄酮提取率影响显著（图5-F）。由此可知，总黄酮提取量与提取时间、 乙醇体积分数呈正比；提取温度以及液料比会对提取效果带来较大影响；各因素之间存在明显的交互作用。同时采用乙醇提取柚子皮总黄酮时，提取温度不宜过高，提取时间不宜过长。柚子皮总黄酮中的柚皮苷为酚羟基化合物，温度过高、时间过长时柚皮苷容易氧化，反而导致提取率下降[10]。endprint

回归分析结果与4个因素对响应值的影响以及各因素之间的交互影响相吻合。在响应面最高点和等高线所选范围内存在极值，即为最优点。综上分析，柚子皮总黄酮最佳提取条件为温度72.39 ℃，液料比为20.40∶1，乙醇体积分数为82.56%，提取时间为1.5 h。根据实际试验条件，将提取条件调整为温度70 ℃，液料比为20∶1，乙醇体积分数为80%，提取时间为1.5 h。在此条件下，重复5次，柚子皮总黄酮提取率接近预测值，证明拟合响应面模型的适用性。因此，响应面设计更好地預测了柚子皮总黄酮的提取效果，可信度高。

3 结论

采用 Design-Expert 8.06软件的Box-Behnken设计原则设计响应面试验，建立数学模型。方差分析结果表明，柚子皮中总黄酮提取量与提取时间、乙醇体积分数呈正比；同时提取温度和液料比也对提取效果影响较大。通过响应优化及根据实际试验条件，柚子皮中总黄酮最佳提取条件为温度70 ℃、液料比为20∶1、乙醇体积分数为80%、提取时间为1.5 h，在此条件下总黄酮提取率可达到0.864%。

参考文献：

[1] 胡 春，丁霄霖.黄酮类化合物的构效关系的研究[J].食品与发酵工程，1996，22（3）：46-53.

[2] 贾冬英，姚 开，谭 敏，等.柚果皮中生理活性成分研究进展[J].食品与发酵工业，2001，27（11）：74-77.

[3] 陈卫东，张友胜，肖更生，等.金柚皮活性成分的提取与蜜饯产品的加工[J].广东农业科学，2004（6）：76-77.

[4] 张甘良，汪 钊，朱国孟.柑桔生物类黄酮柚皮苷生物活性的研究进展[J].天然产物研究与开发，2005，17（B06）：117-120.

[5] 杨晓泉，张海德，李 琳.柚皮黄酮类抗氧化物质的纯化及其降血脂作用的研究[J].营养学报，2004（5）：378-381.

[6] 李春美，杜 靖，谢笔钧.柚皮提取物的抑菌作用[J].食品与发酵工业，2004，30（1）：38-41.

[7] 戴启广，陈国平，王幸宜.新型甜味剂-二氢查儿酮衍生物[J].精细化工中间体，2004，34（3）：7-9.

[8] 阳梅芳.柚子黄酮类物质提取、分离及生物特性研究[D].广州：华南理工大学，2013.

[9] 何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术[M].北京：中国轻工业出版社，1998.

[10] 张 怡，曾邵校，郑宝东.柚子皮总黄酮提取工艺的研究[J].中国农学通报，2011，27（14）：100-103.

[11] 仇 燕，仇彦博.柚皮总黄酮超声波辅助提取工艺的研究[J].河北科技大学学报，2010，31（4）：330-333.

[12] 朱远平.金柚皮总黄酮的微波辅助提取工艺研究[J].食品科学，2009，30（12）：73-77.

[13] 郭俊俊.柚皮中黄酮类物质提取工艺的研究[J].农产品加工，2014（12）：30-32.

[14] 李 歌，王珊珊，丁文君，等.柚皮中黄酮类化合物提取工艺研究[J].生物技术进展，2016，6（2）：125-129.

[15] 杨武英，上官新晨，周志娥，等.柑桔皮总黄酮提取工艺的研究[J].江西农业大学学报，2009，31（2）：345-349.

[16] BEZERRA M A，SANTELLI R E，OLIVEIRA E P，et al. Response surface methodology（RSM） as a tool for optimization in analytical chemistry[J].Talanta，2008，76：965-977.

[17] ZHONG K，WANG Q. Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology[J].Carbohydr Polym，2010，80：19-25.endprint