红菇娘和紫菇娘的组织培养与繁殖

王 波，李 用，吕晓文，姜 成，薛春梅，杜春梅，程海涛，邵 红，孙长利，韩诚武*

(1.佳木斯大学微生物研究所，黑龙江佳木斯 154007；2.佳木斯大学，黑龙江佳木斯 154007；3.佳木斯第二中学，黑龙江佳木斯 154002)

红菇娘(CalyxseuFructusPhysalis)为茄科酸浆属多年生宿根草本植物，原产于我国东北，果实味甘，微酸，可以食用；全株可入药，是一种重要的中草药；野生资源匮乏，人工栽培效率不高[1]，主要通过传统方式繁殖，如种子繁殖、根茎繁殖等，然而种子发芽需要1～2年，用吸芽或根茎繁殖也较慢，且繁殖系数不大，无法突破地域、季节的限制，使锦灯笼不能完全满足实际需要。紫菇娘原产于墨西哥，野生资源匮乏，分布于我国北部松花江支流之一的通肯河流域中上游局部区域；为茄科酸浆属一年生草本植物，暂拟名通肯酸浆(PhysalistungkenensisKuan et Gao)，具有药用价值；由于基因型比较复杂，种子繁殖不易，组织培养成为扩大繁殖和保证这2种稀有野生植物种苗数量和质量的有效手段。

近年来红菇娘果实达10～60元/kg， 紫菇娘种子达1元/粒，市场供不应求，通过多方面对比研究，利用组织培养技术快速繁殖种苗，可降低生产成本，具有很高的经济价值，且对这2种野生资源的保护和开发利用有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1材料供试材料为酸浆属2个野生品种，分别为红菇娘和紫菇娘。

1.2方法

1.2.1红菇娘。

(1)取材与消毒：剪取野生红菇娘幼嫩茎和叶，用流水冲洗15 min，在无菌操作台上，用70%乙醇消毒10 s，0.1%升汞消毒10 min，无菌水冲洗4～5次，切成0.5～1.0 cm，平放于培养基上[2-3]。

(2)诱导培养：以MS为基本培养基[4]，在不同培养阶段分别添加不同浓度的生长调节剂，培养基有MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L；MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L。培养条件为温度(25±2)℃，光照度2 000～4 000 lx，连续光照12 h/d[5]。

(3)继代培养：培养基及培养条件同“(2)”。

(4)生根培养：丛生芽分别在MS培养基和1/2MS培养基(蔗糖减50%)上培养，培养温度(25±2)℃，暗培养。观察生根情况，测定根长，计算生根率。

1.2.2紫菇娘。

(1)种子萌发：将预处理过的种子用75%乙醇消毒15 s，水洗2～3次，用2%次氯酸钠消毒5 min，水洗3～4次，吸干表面水分，接种到1/2MS培养基上。培养温度(25±2)℃，暗培养。

(2)取材：取萌发的无菌苗，切取茎段和幼嫩子叶，平放在愈伤诱导培养基上。

(3)诱导培养：以MS为基本培养基， 在不同培养阶段分别添加不同浓度的生长调节剂，培养基同“1.2.1”。培养条件同“1.2.1”。

(4)继代培养：培养基及培养条件同“1.2.1”。

(5)生根培养：丛生芽分别在MS培养基和1/2MS培养基上培养，培养温度(25±2)℃，暗培养。观察生根情况，测定根长，计算生根率。

2 结果与分析

2.1红菇娘使用幼嫩茎段以及叶片作为外植体培育愈伤组织时[6]，可以观察到愈伤组织的形成时间大约为3 d，形成愈伤组织后，外植体将逐渐变得透明，最后完全变成愈伤组织，形成愈伤组织后，会长出丛生芽及根，颜色又逐渐变回绿色。其中以培养基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L上产生的愈伤组织率、分化率最高。图1为使用红菇娘幼嫩茎段及叶片为材料培育的愈伤组织。

图1 红菇娘愈伤组织Fig.1 Callus of Calyx seu Fructus Physalis

2.2紫菇娘使用1/2MS培养基进行种子萌发需要7 d左右时间，相对于自然状态下种子萌发而言，时间明显缩短，并且萌发率明显升高。图2为紫菇娘培养7、9、11 d后种子的萌发情况。

图2 紫菇娘培养7、9、11 d后种子萌发情况Fig.2 The seeds germination of Physalis tungkenensis Kuan et Gao after cultivating 7，9 and 11 days

将无菌子叶切成0.5 cm×0.5 cm的小块，分别接种于4种培养基上，暗培养3 d后转入光照培养。培养3 d后子叶开始膨大弯曲，培养7 d后陆续产生愈伤组织，培养10 d时所试4种培养基上均产生愈伤组织。进一步培养约14 d后， 在愈伤组织表面首先分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。其中以培养基MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L上产生的愈伤组织率、分化率最高，且能形成大量健壮的不定芽，有利于快速繁殖。图3为使用紫菇娘幼嫩茎段及叶片为材料培育的愈伤组织。

图3 紫菇娘愈伤组织Fig.3 Callus of Physalis tungkenensis Kuan et Gao

2.3继代培养及丛生芽的分化选择由红菇娘或紫菇娘的子叶和茎作为外植体经过脱分化发育而来的愈伤组织作为继代培养的材料。培养基与愈伤诱导培养基成分相同，7 d左右可以明显观察到丛生芽以及不定根的出现，但是由于不同激素浓度的促进生长效果不同，丛生芽及根出现的时间也会有差异。图4、5分别为紫菇娘、红菇娘愈伤组织继代培养情况。

2.4不同培养基对生根的影响将红菇娘和紫菇娘丛生芽放入1/2MS 生根培养基上培养，温度(25±2)℃，光照度2 000～4 000 lx，连续光照 12 h/d，与传统MS生根培养进行比较。在1/2MS 培养基上培养，2种植物培养5～6 d时开始生根，从基部和茎节处产生数条白色且粗壮不定根，传统组培10 d后开始生根，生根时间比传统组培方式提早1/2，红菇娘生根率比传统组培高23%，紫菇娘生根率比传统组培高30%；且紫菇娘的平均根长、生根率均高于红菇娘，1/2MS 培养基上的培养情况优于MS 培养基，可节约成本。

图4 紫菇娘愈伤组织继代培养15 d后的情况Fig.4 Callus of Physalis tungkenensis Kuan et Gao after subculturing 15 days

图5 红菇娘愈伤组织继代培养25 d后的情况Fig.5 Callus of Calyx seu Fructus Physalis after subculturing 25 days

图6 褐化现象Fig.6 Browning phenomenon

2.5移栽在培养室将红菇娘和紫菇娘培养瓶的封口膜打开炼苗3 d，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽到盛有灭菌土的花盆里，套袋保湿。大约7 d后，小苗长出新叶，去除遮盖，移栽成活率为90 %以上。

2.61/2MS液体培养基中愈伤组织的培养愈伤组织在液体培养基中继代培养，第5天便可观察到丛生芽的出现，但是容易发生褐化现象并长菌。

3 结论

该试验对2种酸浆属植物红菇娘和紫菇娘进行了研究，发现通过无菌苗途径得到的愈伤比外植体消毒得到愈伤的生长状态好一些。在愈伤原诱导的环节中，叶片诱导率没有茎段高，且诱导时间稍长，但是由于面积比较大，叶片丛生芽的诱导率相对高一些。且无论是诱导时间，还是诱导率，紫菇娘都好于红菇娘，愈伤组织和丛生芽绿色较深，丛生芽增殖率也略高。相对而言，丛生芽诱导是较好途径。MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L为最适合红菇娘愈伤组织诱导和分化的培养基，而紫菇娘是MS +6-BA 3.0 mg/L和NAA0.03 mg/L，培养14 d后每个愈伤组织能产生3～5个不定芽。继代和生根培养后，丛生芽的成活率为90%以上。

[1] 王波，司亮，罗志文.组织培养在花卉研究中的应用[J].农业工程技术(温室园艺)，2012(10):40，42， 44，46.

[2] 黄海波，淡明，郭安平，等.植物组织培养中存在的主要问题与对策[J].安徽农业科学，2013，34(12):2632-2633.

[3] 胡凯，张立军，白雪梅，等.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学，2011，35(3):680-681.

[4] 王波，王鹤，谭巍，等.仙客来的组织培养及植株再生[J].北方园艺，2007(1):166-167.

[5] FREIBURGHAUS F，KAMINSKY R，NKUNYA M H，et al.Evaluation of African medicinal plants for their in vitro trypanocidal activity[J].Journal of ethnopharmacology,1996,55(1):1-11.

[6] 王喆之，张大力，郝联芳.离体条件下灯笼果花芽形成及开花的研究[J].西北植物学报，1991，11(2):129-133.