灰树花多糖的分子修饰及其活性研究进展

于 萍, 李 倩, 王 未, 郑大恒, 张伟杰, 赵 婷, 张 敏, 茆广华, 冯伟伟, 仰榴青

江苏大学化学化工学院, 江苏 镇江 212013

灰树花(Grifolafrondosa)，又名栗子蘑、贝叶多孔菌、云蕈、舞茸等，隶属多孔菌科(Polyporaceae)，树花属(Ramalina)[1,2]。灰树花肉质脆嫩，是一种高蛋白低脂肪的食品，其子实体和菌丝体中均含有丰富的膳食纤维、蛋白质、氨基酸、多糖、脂类、维生素和钾、磷、铁、锌、钙、硒等多种营养成分[3,4]，具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性，是珍贵的食药两用真菌之一，其中，灰树花多糖是其主要的活性成分之一。

多糖的生物活性与其结构密切相关。对多糖进行分子修饰是提高它原有生物活性或增加新活性的重要途径之一，可扩大多糖的应用范围[5,6]。研究表明，灰树花多糖经过分子修饰后，其空间结构、分子量及取代基的种类、数目和位置均可能发生改变，其物理化学性质和生物活性也随之改变[7]。因此，本文就近年来灰树花多糖分子修饰的主要方法、修饰后多糖的生物活性进行综述，以期为灰树花多糖的深入研究和开发利用提供参考。

1 灰树花多糖的分子修饰

目前，灰树花多糖分子修饰的方法主要分为两类，一类是降解修饰，即通过酶降解、化学降解和联合降解等方式得到不同分子量范围的多糖；另一类是接枝修饰，主要包括硫酸酯化、羧甲基化、富硒和富锌等方式。

1.1 降解修饰

天然多糖一般为高分子化合物，分子量较大，可以达到几十万到几百万不等[8]，导致其粘度高、溶解度低，影响了机体对于多糖分子的吸收。分子降解可以把高分子量的多糖降解为适宜分子量的多糖片段，有利于提高其生物活性。

1.1.1酶降解 酶降解具有高效专一性，同时降解速度快、反应条件温和可控。Fan等[9]考察了纤维素酶、果胶酶和胰酶复合酶解提取灰树花多糖的得率及含量，且比较了酶解前后灰树花多糖的抗氧化活性，结果表明，采用纤维素酶∶果胶酶∶胰酶=2∶2∶1的复合酶解体系提取灰树花多糖，得率和含量分别为21.2%和39.6%，均高于热水浸提法(13.9%和21.3%)，抗氧化活性测定结果表明，复合酶解灰树花多糖对自由基 (·OH、DPPH·、ABTS+)的清除率均高于酶解前灰树花多糖。

1.1.2化学降解 化学降解通常利用硫酸、过碘酸或醋酸酐等进行降解。杨娜等[10]利用甲酸/H2O2/Vc体系对灰树花多糖进行降解，并考察降解灰树花多糖的抑瘤活性和抗氧化活性，结果表明降解后灰树花多糖在琼脂凝胶电泳谱图上有较窄的谱带，迁移率也大于未降解灰树花多糖，表明得到了分子量分布范围较窄的多糖片段(PGF-1和PGF-2)；活性测试结果表明降解后多糖组分均有抑制肿瘤活性,且PGF-2抑制肿瘤的作用和清除自由基能力较好。

1.1.3联合降解 目前，灰树花多糖的降解通常采用联合降解的方式。刘红梅等[11,12]利用微波-复合酶法降解灰树花多糖并考察其免疫活性及抗肿瘤活性，降解条件为微波功率1 400 W，微波辐射30 min，木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶=2∶2∶1的比例复合酶解90 min,活性测试结果表明，降解后多糖有显著的免疫活性且与多糖浓度正相关，且分子量为100 kDa的灰树花多糖有较强的抗肿瘤活性。

1.2 接枝修饰

1.2.1硫酸酯化 硫酸根取代单糖分子上的羟基形成硫酸多糖，也称多糖硫酸酯或硫酸酯化多糖。硫酸多糖包括从海洋多糖、肝素和植物多糖中提取的天然硫酸多糖，以及通过化学修饰等方法人工合成的硫酸多糖[13]。目前，灰树花多糖硫酸酯化常用的方法主要有氯磺酸-甲酰胺法、氯磺酸-吡啶法和三氧化硫三甲胺盐-DMF法[7]。

Nie等[14]利用碱提酸沉法从发酵的灰树花菌丝体中获得水溶性多糖，经过氯磺酸-吡啶法硫酸修饰，得到水溶性硫酸酯化灰树花多糖，测得其硫酸根取代度为1.74。韩建涛[15]通过单因素实验研究氯磺酸-吡啶法修饰灰树花多糖的最佳条件为：吡啶与氯磺酸比例为15∶1，反应温度为80℃，反应时间为3 h，此条件下该硫酸酯化灰树花多糖的酯化度为1.45。高昊东[7]分别考察了氯磺酸-甲酰胺法、三氧化硫三甲胺盐-DMF法和三氧化硫吡啶盐-吡啶法对灰树花水不溶性多糖GF4A硫酸酯化修饰的影响，并通过单因素实验优化工艺，结果表明三氧化硫三甲胺盐-DMF法为最优硫酸酯化方法，最佳反应条件为：三氧化硫三甲胺盐与灰树花多糖比例为5∶1，反应时间为6 h，反应温度为80℃，该条件下，硫酸酯化衍生物的得率为153.7%，硫酸根取代度为1.59，相对分子质量为88 kDa。其中，GF4A以α-1,3-D-葡萄糖和α-1,3-D-甘露糖为主链，β-1,4-D-葡萄糖或α-1,4 -木糖为侧链，其单糖摩尔比为葡萄糖∶甘露糖∶木糖=9∶2∶1。硫酸酯化修饰后C-6位羟基被完全酯化，C-4和C-2位羟基部分酯化。

1.2.2羧甲基化 除硫酸酯化外，羧甲基化也是一种重要的多糖修饰手段，可增加多糖的水溶性进而提高了多糖的生物活性。目前，羧甲基化修饰的一般过程是将多糖分散在异丙醇中，边搅拌边加入固体NaOH，再加入氯乙酸进行非均相取代，得到可溶性羧甲基化多糖[16]。王莹[17]利用二次加碱法进行羧甲基化反应，即部分NaOH用于灰树花多糖的预处理，使多糖充分碱化，另一部分NaOH加入到反应体系中，从而提高氯乙酸的利用率，在该条件下羧甲基化灰树花多糖得率为72%，羧甲基度为1.55，所得多糖分子量为114 kDa。

1.2.3富硒 硒是人体必需的微量元素之一，是体内部分酶的重要组成部分，具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老等活性[2]。硒多糖是硒在生物体内主要的存在形式之一，兼有硒和多糖的双重活性。李玲飞[18]研究了灰树花菌丝体的富硒特性，结果表明低浓度硒可以提高灰树花菌丝体中多糖的含量，在250 μg/g的硒培养基中，灰树花仍能较好生长，说明其有较强的硒耐受性，且其富集硒含量与固体培养基中硒添加量成线性正相关，相关系数为0.9477，有较强的富硒能力。茆广华等[19]通过袋料拌施方式和菌面喷施方式培养获得了富硒灰树花子实体，并考察了不同富硒方式对其生长及产量的影响。结果表明，灰树花子实体的最佳富硒方式为菌面喷施亚硒酸钠5.785 mg/段，产量为28 g/段，硒含量是11.98 μg/g，同时对其生长无明显抑制作用。其中，获得的富硒灰树花多糖以β-1,6-D-半乳糖、α-1,3-D-葡萄糖和β-1,6-D-甘露糖为主链。

1.2.4富锌 锌作为人体必需微量元素之一，是人体多种酶的组成成分，能促进皮肤、骨骼和性器官的正常发育，被称为“生命的元素”。研究表明，人体内锌缺乏会导致儿童生长迟缓、皮肤炎、伤口难愈合和胎儿畸形等症状[20]。Zhang等[21]选取不同浓度的硫酸锌溶液加入到灰树花菌丝体PDA液体培养基中，得到富锌灰树花菌丝体。通过比较培养基中菌丝体的产量和富锌率，确定最佳富锌浓度为50 μg/mL。该条件下，其产量为1.77 g/L，锌含量为16.5 mg/g，富锌率可达到35.2%。其中，锌化前后灰树花多糖的主要成分均为鼠李糖，但其含量较低。

2 分子修饰对灰树花多糖活性的影响

灰树花多糖主要由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖醛酸等组成，不同糖基相互组合、连接、修饰可以形成多种不同的构象，各个糖基在2、3、4位或6位上可以通过α或β糖苷键连接一个残基，从而使灰树花多糖具有多样性[22～25]。目前已发现灰树花多糖的活性组分包括D组分[26]、X组分[27]、MD组分[28]和SX组分等(表1)[29]，D组分与MD组分具有相似的多糖结构，均为含有β-1,3分支的β-1,6-葡聚糖，主要体现为抗肿瘤和调节免疫力等生理活性[30,31]。X组分为含有α-1,4分支的β-1,6-葡聚糖，能够通过提高机体对胰岛素的敏感程度调节血糖血脂水平[32]。多糖的一级结构包括糖基的组成、排列顺序、链接方式及糖链分支的位置、类型和长短等。多糖的生物活性不仅与多糖分子的一级结构有关，高级结构也对其生理活性产生影响。其中，高级结构指以氢键结合的多糖主链的构象、由于糖单元间的非共价作用导致的二级结构空间构象和多聚链间非共价键结合而成的聚集体等[17,33]。分子修饰可以改变多糖的结构进而影响其生物活性。有研究表明，灰树花多糖经分子修饰后，其抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等活性明显增强[34]。

2.1 免疫调节作用

研究表明多糖类化合物是一种很好的免疫调节剂，能够激活免疫受体，提高机体免疫力，同时具有毒副作用小、效果好等优点[35]。郭克晓[36]考察了灰树花多糖(GFD)以及硫酸酯化灰树花多糖(S-GFD)的免疫调节作用。结果表明，灌胃给药10 mg/kg·d时，S-GFD能显著增加小鼠胸腺、脾脏重量，增强正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，且作用显著高于GFD，说明硫酸酯化灰树花多糖的免疫调节作用强于未修饰灰树花多糖。程代等[37]考察了水不溶性硫酸酯化灰树花多糖S-GFP对RAW264.7细胞增殖的影响。结果表明，在一定浓度和时间范围内，S-GFP能显著提高RAW264.7的增殖能力并呈剂量依赖关系，其最佳作用时间为36 h，最佳剂量为40 μg/mL。Mao等[34]研究了富硒灰树花多糖(Se-GP)在小鼠体内的免疫活性，结果发现，与模型对照组相比，在Se-GP剂量为54 mg/kg、108 mg/kg和216 mg/kg时，Se-GP可以显著增加小鼠胸腺指数和血清内肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)的水平，促进巨噬细胞和NO的产生，表明该富硒灰树花多糖具有免疫调节作用。

表1 灰树花多糖中的活性组分及结构Table 1 Active component and structure of polysaccharides from Grifola frondosa.

2.2 抗氧化活性

灰树花多糖具有清除体内自由基、增强机体抗氧化活性、延缓衰老的作用。研究表明，经分子修饰后抗氧化活性明显增强[38]。Fan等[9]考察了灰树花粗多糖(GFP)和复合酶解灰树花多糖(FGFP)的体外抗氧化活性。结果表明，多糖浓度为1 mg/mL时，FGFP对·OH、DPPH·的清除率分别为83.1%和69.7%，明显高于GFP的清除率(43.6%和35.8%)，说明复合酶酶解后灰树花多糖的自由基清除活性高于灰树花多糖。Zhang等[21]考察了灰树花胞内多糖(GIPS)和胞内锌多糖(GIZPS)的体外抗氧化活性和小鼠体内抗氧化活性。实验表明，多糖浓度为400 mg/L时，GIZPS对·OH和DPPH·的清除率分别达到了89.89%和57.73%，显著高于GIPS对·OH和DPPH·的清除率(44.19%和28.40%)，说明GIZPS的自由基清除活性高于GIPS；同时二者都能够有效提高小鼠总抗氧化能力与超氧化物歧化酶含量，降低体内丙二醛含量，从而抵抗机体的活性氧损伤。

2.3 抗肿瘤作用

硫酸酯化灰树花多糖的抗肿瘤活性主要表现为增强机体免疫功能，或直接抑制肿瘤细胞生长。王莹[17]利用S180肿瘤模型小鼠检测硫酸化灰树花多糖的抑瘤活性，结果表明，低、中、高3个剂量组的抑瘤率分别为39.80%、51.74% 和46.77%，均高于香菇多糖对照组抑瘤率33.33%。Wang等[39]研究硫酸酯化灰树花多糖(S-GFP)对人体肝癌细胞 HepG2的抑制作用，结果表明S-GFP对HepG2的抑制作用与浓度呈依赖关系，浓度为61 μg/mL时作用48 h可达50%的抑制率。毛逸嵘等[40]探讨了灰树花多糖及其硫酸酯化衍生物对肿瘤细胞生长的影响，结果表明，硫酸酯化灰树花多糖组分对肿瘤细胞的生长表现出较明显的抑制作用，抑制率最高可达41.45%。杨娜[10]考察了分子降解后灰树花多糖组分PGF-b1和PGF-b2对肿瘤细胞的抑制作用。结果表明，降解后灰树花多糖对荷瘤动物体重均没有明显影响，且高剂量(50 mg/kg·d)的PGF-b2抑瘤效果最好。张媛媛等[41]考察了降解后灰树花多糖组分(GFD-1，29.574 kDa)对HepG2细胞增殖的影响，结果表明经94 μg/mL GFD-1作用48 h后，HepG2细胞的凋亡率从1.89%增至39.27%，说明GFD-1可以诱导HepG2细胞凋亡。茆广华等[19]采用Heps小鼠模型考察了富硒灰树花多糖(Se-GP)和未富硒灰树花多糖(GP)的抗肿瘤活性，发现剂量为54 mg/kg时，Se-GP的抑瘤率可达到64.38%，Se-GP活性显著高于GP。

2.4 调节血糖、血脂作用

灰树花多糖还具有调节血糖、血脂的作用。Konno等[42]研究表明灰树花多糖SX组分可以靶向胰岛素信号，尤其是胰岛素受体，激活受损胰岛素信号通路，从而促进葡萄糖的吸收，具有降血糖活性。杨庆伟等[43]研究发现灰树花菌丝体多糖大多难溶于水，影响其生物活性,因此对灰树花菌丝体多糖进行硫酸酯化以提高其水溶性，同时研究其对小鼠血脂的影响，结果表明，硫酸化灰树花多糖有明显的调节血脂作用，在给药剂量为50 mg/kg·d时，高血脂症小鼠血脂水平明显降低，接近正常水平。

2.5 化疗药物辅助剂

灰树花多糖还能够作为化疗药物的辅助剂。毛逸嵘等[40]用水提醇沉的方法得到灰树花粗多糖GFP，经0.1 g/L叠氮化钠溶液洗脱得GFP-F、GFP-M和GFP-L组分，分别对其硫酸酯化得GFP-FS、GFP-MS和GFP-LS组分。将各组分与阿霉素联用观察其对肿瘤细胞抑制效果。结果表明，硫酸酯化各组分的抑瘤效果显著高于未硫酸酯化的各组分，且GFP-MS组分联用的效果最好，最高可达到64.51%。Louie等[44]研究灰树花多糖D组分和α-干扰素对膀胱癌细胞的抑制试验，结果表明，D组分和干扰素单独作用的抑制率最高分别为53%(700 μg/mL)和66%(50 000 IU/mL)，而D组分和干扰素联合应用的抑制率为75%(200 μg/mL和10 000 IU/mL)，说明D组分可以协同干扰素抑制膀胱癌细胞。茆广华[19]考察了富硒灰树花多糖对抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)的减毒作用，结果表明，富硒灰树花多糖能明显抑制小鼠免疫器官指数和外周血白细胞数量的减少，同时对5-Fu所致的肝损伤有一定的修复作用。

2.6 抗凝血活性

研究表明，硫酸根对硫酸多糖的抗凝血活性起着关键作用[13]。高昊东[7]采用合成的硫酸酯化灰树花多糖进行了家兔抗凝血活性实验。实验结果表明，随着硫酸酯化灰树花多糖浓度的增加，家兔的凝血时间明显延长。在浓度为50 μg/mL时，抗凝血活性最明显，效果相当于同剂量肝素的50倍。Wang等[45]通过考察硫酸化灰树花多糖(S-GFP)对人微血管内皮细胞(HMEC)增殖的抑制作用，检测其抗凝血作用。结果表明，S-GFP处理72 h后，HMEC细胞的增殖明显降低，S-GFP浓度为100 μg/mL时，HMEC细胞的抑制率与时间呈依赖关系。

2.7 其他活性

除以上已报道的活性外，分子修饰后灰树花多糖还具有抗病毒、抗辐射、保护肝脏、抑菌等作用。Komada等[46]通过研究表明D组分和抗菌药物联用可以减少抗菌药物的用量，证明其有一定的抑菌作用。Gu等[47]研究了灰树花多糖D组分与人体α-2b干扰素相结合对乙肝病毒的抑制作用，结果表明，灰树花多糖D组分和人体α-2b干扰素单独作用乙肝病毒的半抑制浓度分别为0.59 mg/mL和1 399 IU/mL，同0.45 mg/mL的D组分灰树花多糖结合后的干扰素半抑制浓度为154 IU/mL，表明灰树花多糖D组分可以协同α-2b干扰素抑制乙肝病毒。Nanba等[28]将肝脏特异性脂蛋白注射到小鼠体内构建肝炎小鼠，通过口服或注射X组分考察其对肝炎小鼠的影响。结果表明，灰树花多糖组分可以激发T细胞活性，从而减轻肝炎病症。熊琪等[48]研究了灰树花多糖对大气细颗粒物PM2.5染毒后的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)损伤的拮抗作用。结果表明，与细颗粒物标准品SRM2786染毒组相比，灰树花多糖与SRM2786(125 μg/mL)共存情况下NR8383的存活率明显提高，说明灰树花多糖可以改善由PM2.5引发的NR8383细胞损伤。

3 展望

灰树花营养丰富，被誉为“真菌之王”，其多糖组分具有多种生物活性。灰树花多糖经分子修饰后可以得到具有多种不同生物活性的多糖衍生物，因此，对灰树花多糖进行深入研究具有重要的理论和实际应用价值。然而，虽然目前对于灰树花多糖有一些研究，但仍存在以下问题：①灰树花多糖分子修饰方法的研究还不够系统全面；②修饰后灰树花多糖结构尚不清楚；③修饰后灰树花多糖的活性作用机制尚不明确；④修饰后灰树花多糖构效关系的研究还不够深入。随着灰树花多糖分子修饰及其活性机制的研究不断深入，灰树花多糖将作为一种安全有效的生物活性物质被广泛应用在食品以及医药领域。

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