谷子逆境相关基因家族研究进展

赵晋锋, 连玲燕, 余爱丽, 王高鸿, 杜艳伟, 李颜方, 张 正, 赵根友

1.山西省农业科学院谷子研究所, 特色杂粮种质资源发掘与育种山西省重点实验室, 山西 长治 046011; 2.山西省长治市城区农林委员会, 山西 长治 046011

谷子(Setariaitalica)又称粟，是禾本科(Gramineae)狗尾草属(Setaria)植物，起源于我国，具有抗旱性强、耐贫瘠等优点，广泛种植于印度、日本以及我国干旱和半干旱地区，是世界上栽培历史最悠久的作物之一，也是我国重要的粮食作物之一[1]。谷子与其他禾本科粮食作物亲缘关系较近,是传统的抗旱耐逆作物，其抗旱耐逆特性早已被人们熟知和接受。因此开展谷子的抗逆研究对于揭示作物的抗逆机理以及通过基因工程技术改善作物的抗逆性具有特别重要的意义。由于谷子是区域性作物，其抗逆相关研究相对滞后。但是随着谷子全基因组测序工作的完成以及研究人员对谷子的高度重视，谷子功能基因组学研究进入了一个新的时代，其抗逆方面的研究也有了长足的发展[2，3]。

植物适应非生物环境是一个复杂的过程，在长期进化中植物已逐渐建立起一套复杂完整的适应和抗性机制。当植物受到胁迫时,体内会产生一系列生理、生化反应,涉及到许多胁迫反应基因的表达与调控。整个过程包括植物细胞对胁迫信号的感知、胁迫信号的传递、第二信使激活一些相关的转录因子、转录因子与顺式元件相互作用诱导基因的表达、表达产物直接作为功能蛋白保护细胞免于受到胁迫的影响或作为转录因子进一步启动另外一些基因的表达,最终体现为植物对胁迫的适应或产生抗性[4]。植物抗逆分子机制的研究目的不仅在于从分子水平上阐明植物适应逆境的机制，更重要的是希望通过研究获得各种抗逆基因用于作物的抗逆育种。目前在谷子中已获得了许多与抗性有关的基因，因此本文概述了近年来谷子抗逆研究的最新进展，展望了谷子基因功能研究的发展前景，以期为揭示植物的抗逆机理以及通过基因工程技术改善植物的抗逆性、提高植物对逆境的适应能力和加快培育抗逆性强的品种等相关研究提供参考。

1 谷子逆境相关转录因子家族

近年来全球人口的迅速增加以及生态环境的不断恶化加剧了环境对农业的负面影响，其中干旱、高盐、冷冻等对植物的影响特别严重,成为制约农业生产的主要环境因子。据调查这些非生物压力严重威胁着农业的可持续发展，导致作物产量平均减少了50%以上[5]。由于谷子基因组小、根系发达、叶片细窄、水分利用率高、蒸腾系数小等特征被认为是传统的抗旱耐逆作物。具有其他禾谷类作物不具备的特殊性状，如抗旱性、耐盐性、耐瘠薄性和抗病虫性等。谷子与其他禾本科粮食作物亲缘关系较近，己经逐步成为未来作物遗传改良育种的理想模式作物。近年来随着分子生物学和测序技术的进一步发展，大量谷子逆境相关的转录因子家族被陆续发现，它们在逆境应答中的功能也相继得到了验证(表1)。

转录因子TFs(transcription factors)可以直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录，在植物对低温、干旱、高盐、抗病等逆境应答以及植物生长发育过程中发挥广泛作用[11,12]。Muthamilarasan等[6]在谷子基因组中发现124 个C2H2型锌指转录因子，同源性及进化分析把这些基因分为5组，基因重复分析显示SiC2H2s在进化上主要以串联复制方式扩展。逆境表达分析表明，不同SiC2H2基因在盐、脱水和低温等不同逆境胁迫下具有特异的时空表达特征，该研究证明了谷子转录因子SiC2H2基因在多种逆境胁迫下可执行不同的生理功能使谷子适应多种环境条件胁迫。Puranik等[7]通过系统序列分析在谷子中鉴定了147个具有NAC结构域的编码基因并将其对应到9条染色体上，所有SiNAC基因被分为11个亚家族。50个代表性SiNACs基因在干旱、盐、低温、ABA、水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理下的早期(1 h)和后期(24 h)表达表明SiNACs基因表达受到多种逆境和激素的影响，说明SiNACs基因可能参与植物响应激素和逆境应答信号途径。Lata等[8]对谷子全基因组进行分析发现了171个AP2/ERF(乙烯应答元件结合因子)基因。对候选的21个SiERFs基因在干旱、盐和ABA、水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理下的早期(1 h)和后期(24 h)表达谱分析中，发现SiERFs基因在植物生长发育以及生物和非生物胁迫反应的过程中扮演着重要的角色。Muthamilarasan等[9]在谷子基因组和转录组数据库中检索到4个组织(根、茎、叶、花)中的105个SiWRKY蛋白、12个候选SiWRKYs基因在逆境(脱水和盐)和激素(脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯)处理下的表达谱分析揭示SiWRKYs基因参与了逆境和激素的信号转导。谷子基因组中存在209个MYB蛋白编码基因最近被报道，所有预测的SiMYBs基因被定位到谷子的9条染色体上。蛋白结构域和进化分析将其分为3大类10个亚家族。11个候选SiMYBs基因在非生物逆境(干旱和盐)和激素(ABA、茉莉酸甲脂、水杨酸)处理下的qRT-PCR分析揭示了SiMYBs基因在植物发育的不同阶段和逆境应答过程中起重要作用[10]。这些研究结果表明谷子中的C2H2、NAC、AP2/ERF、WRKY、MYB等众多转录因子在谷子不同生长发育阶段的逆境应答反应过程中扮演着重要的角色。

表1 谷子抗逆相关转录因子家族Table 1 Transcription factor families related with stress resistance in foxtail millet.

2 谷子逆境相关基因家族

由于谷子基因组测序工作的完成，极大地促进了谷子分子生物学的研究工作，国内外研究者对谷子基因组中存在的逆境相关基因家族进行了广泛的挖掘(表2)。Singh等[13]在谷子基因组中发现了热激蛋白(heat shock proteins)家族，该家族含113个成员分属于5个不同的亚家族。34个候选基因逆境表达分析显示了家族成员具有逆境特异性、组织特异性，其中SisHSP-27在热和盐胁迫下表达量上调了数倍，说明该基因在热和盐胁迫耐性中发挥了一定作用，随后的SisHSP-27在酵母中过表达实验揭示了该基因参与了多种非生物逆境胁迫。含SET结构域的基因家族能够催化组蛋白赖氨酸甲基化，使染色质结构改变并参与调节逆境胁迫下多种发育和生理过程基因的转录。Yadav等[14]在谷子中确定了53个含SET结构域基因，RNA-Seq衍生的表达谱分析表明SiSETs基因主要在叶、根、茎和穗4种组织有表达差异。实时荧光定量PCR对21个候选SiSETs基因在不同的非生物胁迫和激素处理下的表达分析表明这些基因在处理的晚期表达差异明显。自噬在响应植物营养饥饿、衰老和其他环境压力过程中对于调节细胞降解氨基酸再循环起着重要的作用。在谷子基因组中发现了37个ATG自噬相关基因。基因表达分析显示26个SiATGs基因受干旱、盐和冷诱导，24个SiATGs基因被黑暗诱导，25个SiATGs基因被氮饥饿诱导。实时荧光定量PCR结果显示在37个候选基因中，SiATG8a在氮饥饿处理24 h后其表达水平最高，表明其对植株营养饥饿存在潜在作用。此外在水稻中异源表达SiATG8a后，在氮饥饿条件下转基因水稻与野生型水稻相比具有较高的地上总氮含量[15]。类凝集素受体激酶LecRLKs (lectin receptor-like kinases)在植物响应不同环境胁迫过程中起着至关重要的作用。Zhao等[16]发现谷子中存在着113个LecRLKs共有基因(59个G型、53个L型、1个C型)。18个候选SiLecRLKs基因在模拟干旱和高温胁迫下分析表明SiLecRLKs在非生物胁迫反应中发挥重要的作用。基因表达的转录后调控是通过DCL、AGO和RDRs(RNA依赖性的RNA聚合酶)引起的RNA干扰实现的。Yadav等[17]在谷子中鉴定了8个SiDCL、19个SiAGO 和 11个SiRDR 基因。表达谱数据揭示这些基因具有组织特异性表达模式。代表性基因在盐、脱水和激素胁迫下的qRT-PCR分析揭示候选基因参与了非生物胁迫信号应答途径。另外广泛存在于真核生物中参与细胞分裂、mRNA修饰、跨膜信号转导和物质运输等过程的WD40蛋白家族，在多种生理和分子机制中起重要作用。参与提高植物的生物和非生物抗性的ADP核糖基化因子(ARFs)家族、植物发育和逆境刺激应答中发挥重要作用的14-3-3蛋白家族、参与细胞周期调控和细胞凋亡及信号转导等多种生命活动的F-box蛋白家族、在植物逆境环境中起重要作用的醛脱氢酶(ALDH)基因家族以及在植物对干旱、盐渍、低温等逆境胁迫应答中起重要作用的Ca2+感应蛋白(CBL)基因家族相继在谷子基因组中被鉴定出来。对这些家族的代表基因的逆境或激素胁迫下的表达谱分析揭示了这些基因家族参与了植物对逆境的响应，在植物抗逆应答过程中起重要作用[18～23]。以上研究结果表明谷子中的热激蛋白HSP、含SET结构域、ATG自噬相关、类凝集素受体激酶LecRLKs 、WD40蛋白、ADP核糖基化因子、F-box蛋白、醛脱氢酶(ALDH)、CBL等基因家族相继在谷子中被鉴定出来，并且进一步证明其在谷子不同逆境应答过程中起重要作用。

表2 谷子逆境相关基因家族Table 2 Stress related gene families in foxtail millet.

3 谷子逆境相关基因

在谷子基因家族研究基础上，许多逆境相关功能基因也被进一步发掘(表3)。杨希文等[24]克隆了谷子SiDREB2基因并对其功能进行了研究，结果表明谷子SiDREB2的表达受干旱胁迫诱导，推断其可能是谷子抗旱节水的关键基因。NPC类基因在植物处于干旱、高盐、低磷等非生物胁迫条件下时发挥重要的作用，并参与脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BL)等激素信号传导途径。胡利芹等[25]在龙谷25中克隆到一个新的NPC类基因SiNPC4。亚细胞定位结果显示SiNPC4蛋白被定位在细胞质、细胞膜和细胞核中。基因表达谱分析表明该基因主要在谷子根部表达并受干旱、盐、低温、黑暗、ABA、BL、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等的诱导表达。将SiNPC4基因转入拟南芥中，转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA和BL激素的敏感性降低，推测该基因可能作为负调控因子参与植物对ABA和BL激素的响应过程。余琴鸯等[26]利用RT-PCR技术克隆到SiCDPK1基因，实时定量结果显示SiCDPK1基因的表达受PEG、ABA、高盐、自然干旱胁迫诱导。黄锁等[27]从抗逆性强的谷子品种龙谷25中克隆到1个新的NF-Y类转录因子基因SiNF-YA5。亚细胞定位分析表明SiNF-YA5定位于细胞膜和细胞核。基因功能分析显示在不同浓度的高盐处理下SiNF-YA5转基因拟南芥种子萌发率有显著提高；苗期SiNF-YA5转基因拟南芥根表面积和植株鲜重显著高于野生型，说明过表达SiNF-YA5基因可以显著提高植物耐盐性。方广宁等[28]克隆了1个新的NF-Y类转录因子基因SiNF-YA6，表达分析显示SiNF-YA6在受到低氮、高盐、干旱、ABA 胁迫时表达量显著上调。SiNF-YA6通过调控提高了氮转运基因的表达，增加了转基因植株在低氮条件下的抗性。王二辉等[29]筛选到了1个低钾胁迫下表达量上调的SiNAC45基因，表达谱分析显示SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位显示SiNAC45存在于细胞核。基因功能分析结果显示在不同浓度低钾处理下SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加，证明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。余爱丽等[30]从谷子中克隆了SiCIPK6和SiCIPK16基因。逆境表达分析显示两个基因在ABA、低温、高温、干旱、高盐诱导下表达量均有上调，半定量PCR检测表明两个基因在拔节、孕穗、灌浆期受到干旱胁迫时它们表达量均有所提高，推测两个基因在谷子的干旱或其他逆境胁迫中起一定作用。这些实验结论表明在其他植物逆境应答过程中起重要作用的一些基因也在谷子的逆境应答过程中起重要作用。

表3 谷子逆境相关基因Table 3 Stress related genes in foxtail millet.

4 展望

近年来随着自然条件的不断恶化非生物因素对作物的伤害越来越严重，同时全球人口不断增长以及全球普遍存在的饥饿和营养不良问题使粮食安全问题面临更加严重的挑战[31]。因此认识植物对非生物逆境的应答机制，通过基因工程方法提高植物的抗逆性是农业增产的重要措施。随着分子生物学的快速发展，国内外有关逆境胁迫与抗逆机理及其应用研究日益受到重视，研究者在玉米、水稻、小麦、高粱以及模式作物拟南芥中已开展了广泛的探索。目前在植物逆境胁迫下的水分代谢、物质代谢、渗透调节以及活性氧清除能力等领域已取得了重要进展，并且积累了丰富而完善的资料[32]。

由于作物抗逆性是复杂性状，由一系列相关的直接或间接作用的基因形成的一个复杂的网络调控系统，导致目前的研究对抗逆机理的解析仍然不十分透彻。

谷子起源于我国黄河流域，在我国已有8 500多年的栽培史，是我国干旱和半干旱地区广泛种植的区域性特色资源作物。谷子是传统的抗旱耐贫瘠作物，种子发芽需水少、蒸腾系数低、较高的净光合强度和水分利用效率、叶面积小、致密的表皮细胞、增厚的细胞壁、茂密的根系统等特征导致谷子具有独特的抗逆耐瘠机制。近年来随着国内外谷子测序工作的完成以及谷子全基因组序列的公布[33,34], 谷子抗逆关键基因发掘和逆境应答调控机制逐渐成为研究热点。谷子中的一些逆境相关转录因子家族(锌指蛋白、NAC、AP2/ERF、WRKY、MYB)、逆境相关基因家族(热激蛋白、SET、ATG、类凝集素受体激酶LecRLKs、WD40、ARF、14-3-3、CBL)以及逆境相关基因(SiDREB2、SiCDPK1、SiNPC4、SiCIPK6、SiCIPK16)被相继鉴定。相应的逆境胁迫下表达谱及功能研究表明这些基因家族成员在逆境的应答过程中起重要作用。相信利用基因组学方法在谷子中挖掘大量的抗逆性基因，并对其功能进行详细的研究，有助于全面理解植物的抗逆机理，为利用遗传工程提高植物抗性奠定基础。

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