体外受精中无原核胚胎新鲜周期移植与子代出生结局的临床分析

许展 程东凯 刘双 赵雨杰

体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)过程中，正常受精是指卵子于授精后16～20 h呈现2个清晰的原核(pronuclei,PN)，同时有2个极体(polar body,Pb)[1]。IVF-ET周期中优先选择来源于2PN的胚胎进行移植，但有很多周期中含有未见原核(0PN)的胚胎。有文献报道，在IVF-ET周期中，约有30%～40%的卵子在镜下观察表现为未见原核，这部分胚胎能否用于移植、如何选择尚存在争议[2]。也有报道显示，如果在没有正常可利用胚胎的情况下移植0PN(可见2极体)来源胚胎可生育健康子代[3]。本文通过在本生殖中心接受完全来源0PN(可见2极体)的卵裂期胚胎新鲜移植周期的病例进行回顾性分析，患者的妊娠情况，以期了解0PN(可见2极体)卵裂期胚胎的临床应用价值。

对象与方法

1.对象：选择2012年5月—2016年3月在本中心接受IVF-ET治疗(包括常规IVF和常规ICSI)的患者中，新鲜移植周期移植完全来源0PN但可见2极体胚胎的145例妇女。

2.方法

(1)促排卵方案：促排卵采用常规长方案、短方案或拮抗剂方案。B超监测卵泡发育情况，当出现1～2个主导卵泡直径≥18 mm时注射绒毛膜促性腺激素(HCG)(珠海丽珠医药集团股份有限公司)5 000～10 000 IU后约36～38 h在B超引导下经阴道取卵。

(2)精液的准备：患者丈夫取卵日上午手淫取精。采用密度梯度离心后上游法处理精液标本，将吸出的液体置于CO2培养箱中备用。

(3)体外受精-胚胎培养：IVF授精为取卵后2～4 h。精子的授精浓度为(5～10)×105ml。精卵共同培养4～5 h后，脱颗粒细胞，将卵母细胞转移到新的培养皿培养。ICSI是取卵后2h受精后16～20 h观察原核的形成，第2天(D2)第3天(D3)观察胚胎发育情况。

(4)授精评估：授精后16～19 h观察原核。2PN是正常受精，判断标准：可见2个原核且可见极体。0PN判断为可见2个极体未见原核。0PN 2极体判断为2个极体之间有可辨的距离。1PN判断为可见极体和仅见1个原核。根据授精情况不同分组培养。145例妇女均是受精卵D1未见2PN胚胎，D3观察到0PN卵裂来源的胚胎，在患者知情同意后，移植0PN来源的胚胎。

(5)胚胎评分及移植：我中心D3卵裂期胚胎评分标准为Ⅰ级：卵裂球等大均匀，无核碎片≤10%，胞浆饱满，质地均匀；Ⅱ级：卵裂球大小轻度不一致、不对称，无核碎片10%～20%，胞浆饱满，质地均匀度稍差；Ⅲ级：卵裂球大小不一致，不对称，无核碎片20%～50%，胞浆浓缩，质地粗糙；Ⅳ级：卵裂球大小形如碎片不一致，不对称，无核碎片≥50%，胞浆颗粒不均匀；其中Ⅰ～Ⅲ级为可利用胚胎予以移植，移植分裂期胚胎1～2枚。优胚：本实验室将取卵后第三天，正常受精且发育速度正常的胚胎发育至6～8个细胞，卵裂球大小均一、碎片无或小于20%，这些胚胎定义为优质胚胎，其他胚胎(如发育速度过慢，碎片过多)均定义为非优质胚胎。

(6)观察指标及定义：D3胚胎移植后14 d测尿和血清hCG，若阳性定义为生化妊娠；于移植29 d后行B超检测，以宫腔内可见孕囊及胎心定义为临床妊娠。定期随访，记录出生婴儿健康情况。

结果

145例患者的年龄为22～49岁，平均(37.7±5.4)岁。完全来源0PN(可见2极体)的卵裂期胚胎新鲜移植周期中IVF 123个周期，ICSI 22个周期，共获得卵子546枚，平均获卵(3.8±4.3)枚，成熟卵子数411枚，D1天0PN卵子/胚胎280枚，D2天0PN卵裂胚胎245枚，卵裂率为87.5%(245/280)，优胚139枚，优胚率为56.7%，共移植198枚胚胎，周期平均移植数1.37个，D3胚胎着床率为17.7%(35/198)。

临床妊娠28例，胎停2例、无胎心1例、异位妊娠1例、感染引产1例、流血流产1例，22例孕妇活产分娩：23例活产婴儿(1例双胎，为1男1女，其余单胎分别为13男，8女)体检均未见异常，临床妊娠率为19.3%(28/145)。

讨论

在辅助生殖技术助孕过程中，一般选择2PN来源的胚胎进行移植，并认为此类胚胎为形态发育正常的胚胎。但有部分卵子在D1观察判断受精时未见到原核，但D2天又发生卵裂，甚至一部分能发育成形态正常的胚胎[4]。一般认为，此类胚胎不适合进行移植。但有研究表明，0PN(可见2极体)中也存在正常受精的胚胎，这些胚胎染色体正常[5]。

0PN的形成机制可能有以下几个方面：①未受精；②由于原核形成延迟，原核尚未出现或由于原核提前融合而过早消失以至在授精后16～20 h 显微镜下无法观察到原核[6-7]。0PN胚胎可能出现如下情况：①正常受精；②正常受精但存在非整倍体异常[8]；③未受精：孤雌激活，指处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞不经过精子受精，而在某些理化因素的刺激下恢复并完成第二次减数分裂，发生卵裂形成早期胚胎；二倍体双雌胚胎，表现为未见原核及单个极体(1PB)，其形成机制可能是未分裂出来的第二极体参与到核遗传物质的形成[9]；④各种异常受精：多精受精、精子染色体解聚异常、雌性原核形成异常等[10]。由此可见，0PN胚胎中有一部分是正常受精的胚胎[11]。有资料显示，IVF授精后观察为0PN的卵子中大约有20%可发育成正常的胚胎；还有文献报道，0PN胚胎的发生率是12.7%～20.0%[12]。

本研究临床妊娠28例，22例活产，活产出生者体检均未见异常。流产病例没有对绒毛进行染色体检测，无法判断移植的胚胎本身是否正常。以上结果表明，0PN(可见2极体)来源的卵裂期胚胎进行移植可获得正常妊娠结局。因此，如果没有正常受精(2PN)胚胎移植时，可考虑移植来源0PN(可见2极体)的胚胎，但如何选择正常的胚胎进行移植需要进一步研究和探讨；选择来源0PN的正常胚胎，我们可以注意以下几点：①对来源0PN的胚胎，注意选择2个极体的胚胎；②尽可能将来源0PN的胚胎培养至囊胚，从而使胚胎得到进一步的自然筛选[13]；③尽量在授精后16～20 h之间观察原核；④可以选择时差(Time-lapse)摄像系统连续观察胚胎，以避免因局限某一时间观察胚胎而致 PN 数的误判[14]；⑤也可将来源 0PN的胚胎进行 PGS检测后再行移植[15]。

综上所述，无2PN胚胎的情况下，在充分告之病人知情后可行移植0PN但可见2极体胚胎，并需对临床妊娠过程及结局严密观察追踪。